一种小肽的多顺反子串联表达方法

目的：构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,简写为Ecs) 多顺反子串联多拷贝基因。方法：以pMD18T-Ecs为模板,利用三对引物分别扩增Ecs基因,每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子,然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联,再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒,在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导表达,18% SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。结果：Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%,实现了Ecs的串联表达。结论：Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。     

西方蜜蜂Lozenge基因的克隆鉴定及时空表达分析

Lozenge蛋白（Lz蛋白）是昆虫的重要转录因子,在昆虫胚胎发育过程中发挥重要作用。为研究Lozenge在西方蜜蜂Apis mellifera中的作用,本研究克隆了Lozenge基因,并对其进行生物信息学分析,同时基于荧光定量PCR技术检测该基因在西方蜜蜂不同发育时期（卵期、幼虫期、蛹期和成年蜂）和10日龄哺育蜂各组织的表达谱。生物信息学分析结果显示,Lozenge基因的开放阅读框（ORF）为1 554 bp,共编码517个氨基酸,预测分子量为54.63918 kDa,等电点为6.08;结构域预测分析发现Lozenge蛋白含有一个Runt结构域,多物种蛋白序列对比发现该蛋白同源性高。时期表达谱表明,该基因在第1日卵和第2日卵的表达量远高于其他时期,在卵期表达量随时间依次递减,幼虫期表达量极低,蛹期表达量呈先增后减的趋势,而成年蜂中均有表达;组织表达谱显示,该基因在哺育蜂头部、上颚腺中的表达量较高,而在腹部的表达量低。这些结果表明,Lozenge基因可能在西方蜜蜂胚胎期细胞发育过程、哺育蜂蜂王浆合成和分泌过程中发挥重要作用,这些结果为该基因功能的深入研究提供了重要的理论参考。     

人二氢乳清酸脱氢酶蛋白的表达、纯化及其与新型抑制剂的晶体结构

人二氢乳清酸脱氢酶（human dihydroorotate dehydrogenase, hDHODH）是催化嘧啶从头合成途径的一个关键酶。近年来,多种研究表明,抑制该酶可缓解类风湿性关节炎的症状。但该酶的抑制剂甚少,寻找该酶的高效抑制剂具有重要意义。本研究利用PCR技术扩增hDHODH基因,构建重组质粒pET-19b-hDHODH,并在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli ) BL21(DE3)中表达,获得可溶性蛋白质。用Ni2+-NTA亲和层析柱对蛋白质进行纯化,获得较高（90%）纯度的hDHODH蛋白,将蛋白质与抑制剂3-(5-乙硫基)-1H-1, 2, 4-三氮唑-3-)苯甲酸和底物DHO混合孵育。用Hampton试剂盒初筛晶体并用棋盘法进行优化,获得晶形完美、衍射能力很强的hDHODH蛋白复合物单晶。用X射线衍射晶体,用CCP4、Coot软件解析结构,获得hDHODH蛋白复合物晶体结构。从解析的结构中可以看出,抑制剂与蛋白质的吻合度非常高,且抑制剂通过亲水的羧基端与蛋白质356位和147位的酪氨酸形成氢键网络。抑制剂的5元环与蛋白质359位的亮氨酸和360位的苏氨酸相互作用,使抑制剂与蛋白质牢固结合。该复合物晶体结构的顺利解析,将为开发新型特异性抗类风湿性关节炎药物提供重要基础。     

葡萄球菌B型肠毒素突变体的分子设计、高效表达与活性初步研究

葡萄球菌B型肠毒素（SEB0是重要的超抗原,依据SEB分子的晶体结构并结合表面分析,模拟设计了与MHCⅡ类分子和TCR VB区亲合力降低的三位点突变体mSEB(Y89A,C93S,Y94A)。通过PCR重叠延伸法获得突变体基因,导入PBV220载体中,于E.coliDH5α中获得高效表达,纯化的突变毒素T细胞激活活性仅为野生型毒素的1/5左右。     

锦灯笼醇提取物调控SLC7A11/ALOX12通路对乳腺癌细胞铁死亡的影响

该研究旨在探究锦灯笼(PCF)醇提取物通过溶质载体家族7成员11(SLC7A11)/ALOX12通路对乳腺癌细胞铁死亡的影响。该研究选择乳腺癌MCF-7细胞系并将其分为5组:对照组、PCF低浓度组、PCF中浓度组、PCF高浓度组、PCF高浓度+激活剂组。分别进行EdU检测、脂质过氧化检测、铁测定、谷胱甘肽(GSH)含量测定实验;并用qRT-PCR检测细胞中SLC7A11、ALOX12mRNA表达; Western blot检测细胞中SLC7A11、ALOX12蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,PCF低、中、高浓度组MCF-7细胞EdU阳性率, GSH含量, SLC7A11 mRNA及其蛋白表达水平均降低,脂质过氧化程度、亚铁和总铁离子含量、ALOX12 mRNA及其蛋白表达水平升高(P<0.05),且PCF醇提取物对MCF-7细胞的影响随浓度提高而增强(P<0.05)。与PCF高浓度组相比, PCF高浓度+激活剂组细胞EdU阳性率、GSH含量、SLC7A11 mRNA及其蛋白表达水平升高,脂质过氧化程度、亚铁和总铁离子含量、ALOX12 mRNA及其蛋白表达水平降低(P<0.05);而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的加入逆转了PCF醇提取物对乳腺癌细胞铁死亡的影响(P<0.05)。该研究得出PCF醇提取物可能通过调控SLC7A11/ALOX12通路促进乳腺癌细胞铁死亡。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

扶桑绵粉蚧组织蛋白酶B基因的克隆、原核表达和不同发育阶段表达分析

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢过程中发挥重要作用。本研究利用RACE技术克隆了扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinsley组织蛋白酶B基因的开放阅读框（ORF）序列, 命名为PsCb （GenBank登录号: JQ727999）。生物信息学分析表明, 该基因的开放阅读框包含927 bp的片段, 编码308个氨基酸。多序列比对表明, 该基因编码的蛋白在N端变异较大, 在C端保守性高。组织蛋白酶B基因的系统进化树结果表明扶桑绵粉蚧组织蛋白酶独自成为一支。原核表达电泳检测到一条大约35 kDa的目的条带, 与预测的蛋白分子量相符。组织蛋白酶B基因在扶桑绵粉蚧各个虫态均有表达, 卵期表达量相对较低, 2龄若虫期达到最高峰, 然后下降。本研究为进一步研究该基因的功能并开发出组织蛋白酶抑制剂, 从而研制出扶桑绵粉蚧杀卵剂和胚胎发育抑制剂等提供理论依据。     

重组丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

本文旨在获得纯化丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(HCV-C)及抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C与肝细胞相互作用的分子机制奠定基础。首先以HCV1b亚型HC-J4-91全基因组质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HCV-C基因,构建重组质粒pQE31-HCV-C。融合蛋白经原核表达、纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备抗HCV-C多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果显示,表达HCV-C的原核表达质粒pQE31-HCV-C构建正确,获得相对分子质量约22000的纯化融合蛋白。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠的抗血清效价达1:12800。结果显示,自制的抗HCV-C多克隆抗体能特异性识别HCV-C。本研究获得了纯度较好、原核表达的HCV-C,并成功制备了抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C的致病机制提供了有实用价值的研究工具。     

运动小鼠心肌和骨骼肌对支链氨基酸的摄取及其对蛋白质合成的作用

目的和方法：本实验采用昆明种小鼠游泳运动模型,及１５ＮＧｌｙｃｉｎｅ和３ＨＬｅｕｃｉｎｅ同位素示踪技术探讨了运动状态下心肌和骨骼肌对ＢＣＡＡ的摄取量及ＢＣＡＡ对蛋白质合成的作用。结果：运动时心肌和骨骼肌从血循环中摄取ＢＣＡＡ显著增加,同时血清中ＢＣＡＡ的含量降低。结论：心肌和骨骼肌的蛋白质代谢存在差异,骨骼肌的蛋白质合成率高于心肌;运动使心肌蛋白代谢加速,补充ＢＣＡＡ降低了运动对心肌蛋白质代谢的影响,有利于骨骼肌蛋白质合成或使蛋白质分解降低。     

涡虫wnt基因的研究进展

涡虫具有强大的再生能力,对其再生机制等方面的研究一直是发育生物学研究的热点问题。Wnt信号途径是动物发育中关键的信号途径之一,对生物的生长发育有着至关重要的作用,近年来国内外对涡虫的wnt基因进行了不断的深入研究。从Wnt信号途径、涡虫wnt基因的种类及命名、涡虫wnt基因的表达及功能几方面对wnt基因在涡虫中的研究进展进行综述。