蛙病毒同源蛋白RGV-27R和ADRV-85L的表达及其免疫原性分析

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)和大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)同属虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员,是引起水产动物高死亡率的病原。其同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L与蛙病毒代表株蛙病毒3型(Frog virus 3,FV3)25R基因所编码的大小为31kD的早期蛋白P31K(FV3-P31K)同一性超过99%。我们在观察和比较RGV与ADRV感染大鲵胸腺细胞(Giant salamander thymus cell,GSTC)显微病变的基础上,将ADRV-85L和RGV-27R基因分别克隆到原核表达载体pET-32a与pMAL-p5X中,转化宿主菌E·coli BL21(DE3)并诱导表达,经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测,对这两种蛋白的原核表达及其产物免疫原性进行分析。结果显示这两种基因在载体pET-32a中的表达效率要显著高于pMAL-p5X。随后,取高效诱导表达的pET-32a-RGV-27R产物,经Ni-NTA His-Bind亲和层析分离提纯,获得浓度为1.2 mg/mL的融合蛋白His-RGV-27R,用其免疫动物,制备了抗体27R-Ab,酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗体的效价为1∶6.25×10~6。用经正常大肠杆菌菌液和正常GSTC细胞悬液吸附处理后的抗体作为一抗,对被RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液进行Western Blot检测,并以重组原核质粒表达的融合蛋白His-RGV-27R和HisADRV-85L作为阳性对照,以正常GSTC细胞悬液为阴性对照,分别从RGV或ADRV感染的GSTC细胞悬液中,检出大小同为31kD的特异性蛋白条带。本研究证实两种蛙病毒同源早期蛋白RGV-27R和ADRV-85L不仅都能在两栖动物细胞中表达,且具有相同的抗原特性,这为深入研究这类病毒蛋白对蛙病毒复制的影响及其与宿主相互作用的分子机制提供了实验材料。     

自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。     

安徽省急性胃肠炎疫情相关GⅡ.P17-GⅡ.17基因型诺如病毒分子特征研究

诺如病毒(Noroviruses,NoVs)是引起病毒性胃肠炎的重要病原体,本研究旨在对2015～2016年春季安徽部分地区暴发的急性胃肠炎(Acute gastroenteritis,AGE)疫情标本进行病原检测和分子分型,分析病原的基因特征。收集2015年3月至2016年5月9起AGE疫情流行病学信息和采集病例粪便、肛拭子样本。采用Real-time PCR检测NoVs核酸和RT-PCR扩增RdRp与VP1区基因序列,基因测序后应用BLAST比对和NoVs在线分型工具分析结果。7起疫情发生在中、小学校(77.78%,7/9),2起疫情发生在乡镇,发病人数中位数为6人,男女发病比例为1.41∶1,临床表现主要以恶心、呕吐/腹泻、腹痛为主。77份临床病例样本中检出66份NoVs核酸阳性,基因序列测定获得76条序列,39条序列为RdRp区GⅡ.P17基因型,37条序列为VP1区GⅡ.17基因型。基因进化树分析显示:2015～2016年安徽地区39条RdRp区NoVs GⅡ.P17基因型序列Cluster III进化簇III b分支,与2015年广东、海南、中国台湾地区参考毒株序列有较近的亲缘性关系,核苷酸同源性为99%～100%。37条VP1区NoVs GⅡ.17基因型序列都处在Cluster III进化簇上,其中28条序列属于III a进化分支,与山东2015年LX09株、2016年广东GZ2016-L492株、江苏zj019株、中国香港CUHK-NS-942株以及日本2015年AichiF101毒株序列有较近的亲缘性关系。新型GⅡ.P17-GⅡ.17基因型NoVs是引起2015年和2016年春季安徽部分地区AGE暴发的主要病原体,需加强病毒性胃肠炎流行病学调查与病原监测及分子分型鉴定工作。     

有机溶剂/去污剂病毒灭活处理对破伤风抗毒素质量的影响

目的 探索用有机溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)病毒灭活处理对破伤风抗毒素质量的影响。方法 3批破伤风抗毒素样品,每批样品取3等份,向其中2份中分别加入磷酸三丁酯(tri- n -butylphosphate, TNBP)和吐温-80(Tween 80)至终质量分数为0.3%和1%;一份放置在(25±1)℃水浴中振摇6 h后取样,另一份放置在(30±1)℃水浴中振摇4 h后取样;向第3份破伤风抗毒素原液中加入等量的生理盐水混匀后室温放置作为对照。各样品经超滤后检测其效价和蛋白质含量,同时用SDS-PAGE电泳和凝胶过滤色谱柱测定。结果 破伤风抗毒素原液样品经过S/D病毒灭活处理后,其动物效价与对照相比差异无统计学意义( P >0.05),蛋白质含量、分子大小分布无明显变化,多聚体、二聚体及F(ab′) 2含量也无明显变化。结论 S/D病毒灭活处理对破伤风抗毒素的效价,蛋白质含量,分子大小分布,多聚体、二聚体及F(ab′) 2含量均无明显影响,可以作为破伤风抗毒素病毒灭活的候选方法。     

人嗅黏膜间充质干细胞来源外泌体的分离鉴定及生物学特性研究

外泌体是指释放到细胞外微环境中的直径约50～130 nm的纳米级的膜性囊泡。嗅黏膜间充质干细胞（olfactory mucosa mesenchymal stem cells,OM-MSCs）作为一类新发现的间充质干细胞,在许多疾病中均具有治疗作用,且其内在机制与其旁分泌的外泌体密切相关,但OM-MSCs外泌体的分离、鉴定及生物学特性的研究尚未见报道。本研究采用超速离心法提取OM-MSCs培养液中的外泌体,应用流式细胞术及免疫荧光进行细胞鉴定后,分别用透射电子显微镜、纳米粒径分析及Western印迹对外泌体形态、颗粒大小和表面的特异性分子标志进行分析鉴定。采用CCK8增殖实验,Western印迹和划痕实验,分析其对人脑微血管内皮细胞增殖和迁移的影响。电镜、Western 印迹和纳米粒径分析的结果显示：OM-MSCs来源外泌体形态多为圆形,直径约为40～150 nm;表达外泌体标记物CD63,CD81;CCK-8法检测显示：不同浓度的OM-MSCs源外泌体可提高人脑微血管内皮细胞的增殖活性,且其增殖促进作用具有浓度依赖性（P<0.05）。Western 印迹检测结果显示：相比空白对照组,OM-MSCs源外泌体可显著提高内皮细胞的增殖细胞核抗原蛋白质水平表达（P<0.01）,细胞划痕实验结果显示,OM-MSCs源外泌体可增强内皮细胞的迁移能力,且高于对照组（P<0.01）。本研究表明：通过超速离心法可以分离纯化获得OM-MSCs源外泌体,且该外泌体具有促进人脑微血管内皮细胞迁移和增殖的作用。     

模型膜实验方法在β淀粉样蛋白与细胞膜间相互作用中的应用与改进

β淀粉样蛋白(amyloid β peptide,Aβ)与细胞膜间的相互作用很可能是阿尔茨海默症病(Alzheimer disease, AD)重要的风险因素。模型膜研究方法在该领域的应用和更新持续至今,但仍存在一些问题有待解决,例如,Aβ插膜后聚集状态与Aβ融合到脂质体膜聚集状态的差异,Aβ插膜后形成微通道的时间及与磷脂成分的关系等。本文试图解析这两个问题,同时,系统地总结出常用的和更新的模型膜研究方法,这些方法包括单层膜插膜及电镜样品的制备,脂质体制备方法的改进,脂质体膜上Aβ42经过高盐及酸清洗后的Western 印迹检测,ANTS-DPX研究脂质体泄漏等。研究结果显示：(1)胞外及膜内Aβ42单体与脂质体膜作用后的聚集状态存在差异,Aβ42单体插膜后更容易聚集成纤维,而膜内融合的Aβ42呈现寡聚体形式;(2) Sepharose CL-4B柱过滤比微型挤出器制备的脂质体更加均一分散;(3)Aβ42在膜上形成微通道很可能是一个缓慢的过程,且与脂质体的磷脂种类相关。这些方法为Aβ42与细胞膜的相互作用提供了实用的研究手段,同时也为其他膜蛋白质与细胞膜的相互作用提供了可以借鉴的办法。研究结果使β淀粉样蛋白代谢过程更加清晰。     

Kremen2生物学功能研究进展

Kremen2 (kringle-containing transmembrane protein 2)是经典Wnt信号通路中的重要调控因子。起初Kremen2蛋白仅被认为是Wnt信号通路的抑制因子,但后期研究发现Kremen2蛋白在某些特定的生物环境中却发挥促进Wnt信号通路活化的作用。在对Wnt信号通路的调控过程中, Kremen2蛋白需要与多种蛋白质调控因子相互作用,以参与胚胎发育、骨形成、肿瘤发生等多种生理病理过程。通过对Kremen2相关研究文献的整理,本文综述了Kremen2蛋白的发现与分子结构,以及其主要的相互作用因子和蛋白质功能,并提出了相关研究展望。     

上调CTRP4基因表达通过抑制炎症因子调控食欲调节相关蛋白的表达

上调中枢补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白4(complement-C1q/tumor necrosis factor-related protein 4,CTRP4)可以改变下丘脑食欲调节相关蛋白的表达,抑制小鼠摄食且降低其体重。然而,CTRP4如何调控食欲调节相关蛋白的表达尚不清楚。本研究通过上调小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)中的CTRP4,探讨CTRP4调控食欲调节相关蛋白的潜在作用机制。通过对N2a细胞未做干预、转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组腺病毒和CTRP4过表达重组腺病毒,将其分为空白对照组(Control组)、阴性对照组(Ad-GFP组)及CTRP4过表达组(AdCTRP4组)。干预72 h时,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞CTRP4 mRNA表达,采用Western印迹检测细胞CTRP4、Pomc、Npy、p-STAT3/t-STAT3、TNF-α、IL-6、SOCS3在蛋白质水平的表达。结果显示,与对照组相比,Ad-CTRP4组的CTRP4 mRNA水平(26 258. 44±10 403. 47vs. 1. 81±0. 79 vs. 1. 00±0. 00,P<0. 01)及蛋白质水平显著增加(10. 44±7. 99 vs.0. 64±0. 62 vs.1. 00±0. 75,P<0. 01)。Ad-CTRP4组的p-STAT3/t-STAT3(3. 38±1. 70 vs. 0. 86±0. 57 vs. 1. 00±0. 63,P<0. 01)和Pomc(1. 81±0. 19 vs. 1. 15±0. 18 vs. 1. 00±0. 22,P <0. 01)表达均显著增高;SOCS3(0. 69±0. 15 vs. 1. 00±0. 12 vs. 1. 00±0. 07,P<0. 01),IL-6(0. 40±0. 19 vs. 1. 03±0. 17 vs.1. 00±0. 16,P<0. 01),TNF-α(0. 39±0. 27 vs. 1. 05±0. 46 vs. 1. 00±0. 29,P<0. 05)及Npy (0. 55±0. 14 vs. 1. 21±0. 38 vs. 1. 00±0. 24,P <0. 05)表达均显著下降。上述结果提示,在N2a细胞中,上调CTRP4可能通过抑制炎症因子TNF-α和IL-6,降低负性调节因子SOCS3的表达,增加STAT3磷酸化表达水平,从而调控食欲调节相关蛋白的表达。     

CDK12主要生理功能与其在肿瘤发生中作用的研究进展

周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)是细胞周期和基因转录的关键调节因子,其调控异常是促进肿瘤发生的重要因素。CDK12是一种与转录相关的周期蛋白依赖性激酶,可使RNA聚合酶Ⅱ碳端氨基酸(carboxy terminal domain of RNA polymeraseⅡ, RNA pol II CTD)中的丝氨酸磷酸化,并参与多种细胞生理过程,如DNA损伤反应、细胞增殖和分化以及m RNA剪接和转录前m RNA加工等。此外, CDK12编码基因的突变将导致多种细胞过程调控异常,基因不稳定性增加,这都可能促进肿瘤的发生发展。本文将重点讨论细胞中CDK12调节转录调控、RNA剪接、细胞成熟和分化、DNA损伤修复(DNA damage repair, DDR)的机制以及其基因突变对于正常细胞的影响,旨在阐明CDK12的主要生理功能及其在肿瘤发生发展中的作用,为临床各类肿瘤的靶向药物研究提供帮助。     

稳定表达RFP-GFP-LC3的大鼠胰岛β细胞株的构建

为了简便自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,实验通过慢病毒转染技术,将RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛β细胞株(RIN-m5f),用G418对感染细胞进行筛选,激光共聚焦进行活细胞拍摄验证,得到100%表达RFP-GFP-LC3质粒的细胞株。无血清饥饿处理细胞,结果显示:饥饿组GFP/RFP荧光点比值较对照组下降, P62蛋白表达量以及S6K磷酸化水平降低,加入10μmol/L氯喹部分抑制自噬后, GFP/RFP荧光点比值回升。以上结果表明稳定表达RFP-GFP-LC3的RIN-m5f构建成功,并能够以简单的检测方式准确表达自噬全过程,为自噬在糖尿病药物机理方面的研究奠定了基础。