新合成的7-氮杂异靛蓝的体内外抗肿瘤作用

对新合成的7-氮杂靛玉红类衍生物N1-(正–丁基)-7-氮杂异靛蓝[N1-(n-butyl)-7-azaisoindigo,7-AI-b]的体内外抗肿瘤作用的研究,为研发具有自主知识产权的靛玉红类抗肿瘤新药打下基础。以不同浓度的7-AI-b作用于肿瘤细胞,MTT法检测细胞活性;建立Heps肝癌荷瘤小鼠模型,评价7-AI-b的体内抗肿瘤作用;计算肝脏指数(liver index,LI)、胸腺指数(thymusindex,TI)、脾脏指数(spleen index,SI),评价化合物的毒副作用;紫外法检测小鼠血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量;HE染色观察肿瘤组织的变化;试剂盒检测细胞周期激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)的活性。结果发现,7-AI-b抑制肿瘤细胞增殖的IC50值为28~40μmol/L,并以时间和剂量依赖性方式抑制A549细胞的增殖。7-AI-b对Heps肝癌具有抑制作用且抑瘤率达到61.85%,与5-Fu的相近;而7-AI-b对于小鼠的毒副作用明显小于后者,表现为体重正常增长,TI、SI和LI均无明显降低;等剂量的7-AI-b效果也明显优于靛玉红;并且7-AI-b能增强荷瘤小鼠的抗氧化能力,使得MDA水平降低,GSH水平升高。另外,7-AI-b对于正常肝细胞株WRL-68和肝癌细胞HepG-2的毒性作用有明显差别,即具有一定的肿瘤细胞选择性。然而,7-AI-b对CDK2/cyclinA的抑制作用较弱。由此,7-AI-b可有效地抑制肿瘤的生长,且毒副作用较小,其机制可能与抑制细胞周期激酶CDKs有关,所以7-AI-b可以作为新型抗肿瘤药物进行研究。     

组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂合成靛蓝和靛玉红

从嗜高温放线菌Thermobifida fusca中分离得到的苯基丙酮单加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反应。对该酶的结构和功能进行研究时,发现位于底物结合口袋的Met446位点突变可以赋予突变酶催化C-H键活化的新功能,氧化吲哚合成靛蓝和靛玉红,但产量仅为1.89 mg/L。为了获得合成靛蓝和靛玉红的全细胞催化剂,直接补加吲哚并不能提高细胞合成效率,补加吲哚的前体物质L-色氨酸可以使细胞合成靛蓝和靛玉红的能力提高4.5倍,达到8.43 mg/L。为了进一步提高细胞的生物合成效率,通过代谢工程改造大肠杆菌的糖代谢途径,阻断葡萄糖异构酶基因pgi,使磷酸戊糖途径代替糖酵解途径成为葡萄糖的主要代谢通路,从而为细胞提供更多氧化吲哚所需的辅因子NADPH,导致细胞合成靛蓝和靛玉红的效率进一步提高3倍,达到25 mg/L。通过组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂不仅可以高效地合成靛蓝和靛玉红,而且设计理念为相关全细胞催化剂的开发提供了一种新的策略。     

Burkholderia sp. IDO3中靛蓝合成基因的克隆表达及其合成特性

【目的】克隆和表达靛蓝合成基因,并将其用于靛蓝合成研究。【方法】对菌株Burkholderia sp.IDO3中靛蓝合成基因进行克隆和大肠杆菌异源表达,构建能合成蓝色色素的基因工程菌。利用液相色谱和质谱对产物进行分析,采用单因素法对培养温度、转速、培养基成分等进行优化,并考察优化条件下的靛蓝合成曲线。【结果】构建了一株重组大肠杆菌E.coli IND_AB,该菌株能够在LB培养基生长的过程中合成蓝色色素,产物分析表明该色素为靛蓝;菌株IND_AB在30°C和150 r/min条件下能在LB培养基中合成22.9 mg/L靛蓝,优化培养条件后产量达到25.4 mg/L;优化LB培养基各组分浓度后产量可提高到35.1 mg/L;外加50.0 mg/L吲哚或0.1 g/L色氨酸后靛蓝产量可分别提高到57.7 mg/L和64.4 mg/L,相比初始产量提高了152.0%和181.2%;靛蓝合成曲线表明在添加吲哚或色氨酸的培养基中,菌株IND_AB前6 h没有靛蓝生成,6-15 h为靛蓝合成加速期,18 h达到产量平衡。【结论】重组大肠杆菌IND_AB可用于生物合成高纯度靛蓝,为靛蓝的微生物合成提供了有效的基因资源。     

萘质粒转移到大肠杆菌中合成靛蓝的研究

利用含有萘降解质粒的假单胞菌,通过接合和转化,把这种质粒转移到大肠杆菌中,获得接合子和转化子。这种接合子和转化子不仅在L-培养基中能合成靛蓝,而且能在以萘作唯一碳源和能源的培养基中生长繁殖。因此,本工作不仅为微生物合成染料开拓新的途径,而且对研究环境有毒污染物降解菌的遗传工程也具有一定的意义。     

靛蓝及其同类色素的微生物生产与转化

靛蓝类色素广泛应用于印染、食品和医药工业, 其环境友好的合成或生产途径越来越受到人们的关注, 特别是微生物生物合成。已经鉴定和分离了能够合成靛蓝类色素的多种微生物, 并且明确了起催化作用的主要是单加氧酶和双加氧酶。已经克隆和利用了一些加氧酶的基因, 构建了工程菌, 优化了其发酵过程。同时, 微生物合成靛蓝的生物转化也已经起步。这些进展将带来环境友好的靛蓝类色素的合成与生产。