共表达极端菌伴侣蛋白prefoldin提高P450 BM3突变体催化效率

P450 BM3来源于巨大芽孢杆菌,其突变体(A74G、F87V、L188Q、D168H)能够在大肠杆菌细胞内催化吲哚合成靛蓝．然而在常规的培养条件下(37℃,250 r/min),大肠杆菌细胞内靛蓝的生物转化量极低．本文将极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus的分子伴侣蛋白与P450 BM3突变体在大肠杆菌进行共表达,以研究分子伴侣蛋白是否能够提高靛蓝的生物转化量．实验结果表明,极端嗜热古菌的分子伴侣蛋白prefoldin能够显著提高靛蓝的产量．同时,实验结果发现prefoldin能够明显提高大肠杆菌细胞内的NADPH/NADP+比率．鉴于NADPH是参与靛蓝生物转化过程的重要因素,靛蓝生物转化量的显著增加可能与该比率的提高有关．     

定向进化细胞色素P450BM-3的研究

以来自于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450BM-3为研究对象,采用随机突变和饱和定点突变定向进化技术对P450BM-3进行改造,通过突变体催化靛蓝显色的特性采用活性琼脂平板分析和96微孔板相结合的高通量筛选成功获得了几个具有更高催化性能的突变体。     

根部淹水对菘蓝活性成分的影响

对菘蓝幼苗根系进行不同深度的淹水处理,采用HPLC法测定不同处理下菘蓝叶中靛蓝、靛玉红的含量。结果表明,淹水处理初期样品与对照相比,靛蓝的含量呈上升趋势,淹水后期急剧下降;靛玉红含量在淹水第1d急剧上升,之后随淹水时间延长不断降低。淹水深度越深对靛蓝、靛玉红含量影响越大。适当的淹水处理能诱导菘蓝叶中次生代谢产物靛蓝、靛玉红的合成与积累。该结果可为栽培菘蓝的质量控制和有效利用提供理论依据。     

假单胞杆菌2-萘酸加氧酶基因的克隆与表达

采用Cosmid pLARF1构建了完整的2-萘酸代谢菌2-NAT菌株的基因文库.通过分析基因文库中产生蓝色色素的克隆验证了2-萘酸代谢基因在大肠杆菌体内得到表达,并导致重组细菌产生靛蓝.从产生靛蓝的克隆抽提重组的Cosmid DNA进行酶解分析,发现所有能产生靛蓝的克隆均含有一大小相同的DNA片段.用重组细菌进行靛蓝生物合成的试验展示了微生物法生产靛蓝的美好前景.     

三相鼓泡塔生物反应器培养云芝菌合成漆酶

为了提高云芝菌发酵生产漆酶的效率,提出了一种利用自絮凝菌丝球在三相鼓泡塔生物反应器中重复分批发酵产漆酶的新方法。在优化后的产酶条件下,考察维生素C的添加浓度对漆酶活力的影响,并通过在培养基中添加维生素C进行漆酶多批次培养。研究结果表明,维生素C的添加浓度为1.50mmol/L时,可使漆酶活力提高2.6倍。连续进行了10批培养,每批最大漆酶的活力均在1000 U/mL以上,最高酶活出现在第五批为1919.6 U/mL,总培养时间达25 d。此方法所得漆酶对染料靛蓝具有明显的脱色降解作用,在介体1-羟基苯并三唑（HBT）用量0.10%,漆酶用量100 U/L条件下作用40 min时,靛蓝脱色率达到96.7%。该方法采用的三相鼓泡塔生物反应器性能稳定、菌丝球可重复使用,该方法有利于漆酶的高效、规模化生产。     

我国蓝草的传统植物学知识研究

蓝草在我国历史上曾是重要的经济作物,蓝草制备的植物靛蓝具有抗菌消炎和抗紫外线等保健作用,然而在合成靛蓝商业化的冲击下,蓝草制靛技艺几乎消亡。近年来,伴随着人们对环保和生物多样性的关注,植物靛蓝需求量不断增加,对蓝草的研究也越来越受关注。该文在文献研究的基础上,简要介绍了我国民间利用的蓝草种类及分布,对我国蓝草制靛工艺的发展进行了梳理,重点阐述了制靛工艺原理和工艺传承现状,并对存在的问题进行了讨论。结果表明:文献记载的我国蓝草共10种及变种,分属于6科6属,现利用的蓝草仅5种;我国蓝草制靛工艺从浸揉染色法发展为固态发酵制蓝法和液态发酵制靛法,只有液态发酵制靛法沿用至今;制靛工艺是将蓝草中的前体物质转化为靛蓝并伴有靛玉红等副产物生成的过程,影响靛蓝纯度的因素包括蓝草的材料选择、温度、浸泡时间、pH值、溶氧量等。目前我国蓝草的研究已取得了一些成果,但在蓝草种类的古籍考证、蓝草种质资源的挖掘以及蓝草传统制靛工艺的还原和再现等方面仍有待于进一步研究。     

海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173合成的2-吲哚酮生物碱

【背景】海洋来源的天然产物近年来已成为小分子药物的重要来源。对海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173的基因组分析显示,该菌包含多种天然产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】挖掘B9173菌株中未知的次级代谢产物,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物。【方法】利用HPLC/LC-MS结合的方法,排除了该菌株产生的已知化合物,确定3个未知化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,最后得到化合物单体。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定。【结果】确定3个化合物分别是色胺酮、甲基异靛蓝和N,N-二甲基异靛蓝,三者都属于2-吲哚酮生物碱。其中色胺酮具有非常广的生物活性,包括抗菌、抗肿瘤、抗炎症等,是药物开发的良好前体,这是首次在细菌中被分离得到。甲基异靛蓝是我国临床治疗慢性粒细胞白血病的药物,这是首次在微生物发酵液中被分离得到。目前这3个化合物均主要依赖化学合成。本研究结合B9173菌株的代谢背景,推测了3个化合物的生物合成途径。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从B9173菌株的发酵液中分离鉴定了3个2-吲哚酮生物碱,丰富了微生物活性天然产物的种类,对3个化合物生物合成途径的推测也为进一步研究色胺酮和甲基异靛蓝的生物合成机制奠定基础,后续可利用合成生物学技术重构这类化合物的生物合成途径,提供更便捷、低成本的生物合成方法。     

部分氧化的铁钼蛋白的圆二色散谱和电子顺磁共振谱的研究

棕色固氮菌固氮酶FeMo蛋白与过量（5－6个当量）的酸性靛蓝保温30－60分钟后,蛋白中的P－金属原子族全部氧化,然而蛋白中的FeMoCo全都处于还原状态。Na2S2O4使这种部分氧化的FeMo蛋白中的P-ciuster重新不,甲基紫精可加快这种还原,而亚甲蓝等氧化剂则使这种蛋白中的FeMoCo受到氧化,对这种部分氧化的FeMo蛋白分别进行CD还原滴定和测定氧化过程中的EPR／ABS的变化已经得到p-Cluster和FeMoCo的氧化还原当量数目。     

组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂合成靛蓝和靛玉红

从嗜高温放线菌Thermobifida fusca中分离得到的苯基丙酮单加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反应。对该酶的结构和功能进行研究时,发现位于底物结合口袋的Met446位点突变可以赋予突变酶催化C-H键活化的新功能,氧化吲哚合成靛蓝和靛玉红,但产量仅为1.89 mg/L。为了获得合成靛蓝和靛玉红的全细胞催化剂,直接补加吲哚并不能提高细胞合成效率,补加吲哚的前体物质L-色氨酸可以使细胞合成靛蓝和靛玉红的能力提高4.5倍,达到8.43 mg/L。为了进一步提高细胞的生物合成效率,通过代谢工程改造大肠杆菌的糖代谢途径,阻断葡萄糖异构酶基因pgi,使磷酸戊糖途径代替糖酵解途径成为葡萄糖的主要代谢通路,从而为细胞提供更多氧化吲哚所需的辅因子NADPH,导致细胞合成靛蓝和靛玉红的效率进一步提高3倍,达到25 mg/L。通过组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂不仅可以高效地合成靛蓝和靛玉红,而且设计理念为相关全细胞催化剂的开发提供了一种新的策略。