BMP9诱导人脐带间充质干细胞体内外成骨分化的作用研究

目的:探讨人骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)在体内外诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)成骨分化的作用研究。方法:设立Ad-BMP9处理组和Ad-GFP对照组感染hUC-MSCs,两组细胞分别于3天、5天、7天进行ALP活性检测,14天后采用免疫组织化学染色检测骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopotin,OPN)的表达情况,21天后茜素红染色检测矿化结节的形成;然后收集不同分组hUC-MSC用于裸鼠皮下注射成骨模型的建立,4周后取出离体骨进行Micro-CT扫描和分析,并进行H&E、Masson Trichrome、Alcain Blue染色。结果:BMP9处理组的ALP活性和矿化结节形成明显高于对照组,免疫组化染色结果显示BMP9诱导组的OCN、OPG的阳性表达明显高于对照组;裸鼠皮下注射成骨模型的观察结果显示,空白对照组没有形成肉眼可见的皮下包块,仅感染Ad-BMP9的hUC-MSCs能生成异位骨,且形成的异位骨骨量明显,骨密度平均值为396.05±0.60;H&E染色结果显示BMP9诱导生成的异位骨中形成部分成熟的骨基质和骨小梁,Masson Trichrome染色结果显示BMP9明显诱导hUC-MSCs的基质矿化作用,Alcain Blue染色结果显示BMP9明显诱导hUC-MSCs的软骨内成骨作用。结论:BMP9成功诱导人脐带间充质干细胞的体内外成骨作用,为临床骨组织工程的细胞疗法提供了明确的可行性。     

干扰Sema7A抑制C2C12成肌细胞的增殖和分化

为研究脑信号蛋白家族（Semaphorins）成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,用此siRNA转染C2C12成肌细胞．通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,real-time qPCR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,C2C12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高．免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHC+细胞所占比例均显著降低．Real-time qPCR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHC的mRNA及蛋白质表达均下降．进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调．以上结果表明,Sema7A可以调节C2C12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.     

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对皮肤成纤维细胞增殖和衰老的影响

不同浓度尖顶羊肚菌胞外多糖提取物作用人皮肤成纤维细胞（human skin fibroblasts,HSF）,检测对HSF细胞形态、细胞增殖、衰老相关β-半乳糖苷酶活性、羟脯氨酸含量的影响,探究尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对HSF增殖和衰老的影响。结果显示,125μg/mL尖顶羊肚菌胞外多糖提取物使HSF细胞活力增加了25.2%,羟脯氨酸含量增加了12.1%,β-半乳糖苷酶活性降低了48.1%。说明适宜浓度尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有促进HSF细胞增殖、胶原蛋白合成,延缓细胞衰老的作用。     

Cucumis hytivus染色体组间交换重组及其对雄配子育性的影响

采用染色体压片技术对双二倍体种Cucumis hytivus染色体组间交换重组及其对雄配子育性的影响进行了细胞学研究。找到了该物种染色体组间交换重组的细胞学证据:包括前期的"8"字形、"十"字形结构和中期环状、链状多价体。研究还发现各种可能导致遗传物质不均衡分离的异常结构如染色体桥、染色体滞后、染色体组分离、微核等。染色体组间广泛的交换和重组导致约93%的多分体及部分异常四分体的形成,多分体中大量的畸形小孢子和四分体中遗传物质不平衡的小孢子因不能正常发育而最终形成败育的雄配子,直接影响到Cucumis hytivus育性。     

逆转座子Tos17的激活与水稻白叶枯病成株抗性的关系

为了研究水稻白叶枯病成株抗性是否与逆转子激活有关,运用SSAP (sequence-specific amplification polymorphism) 对成株抗性品种苗期和成株期接种白叶枯病原菌、清水接种及健康植株的基因组进行了逆转座子扫描。在筛选的约2000个逆转座子基因片段中,9个受苗期生长发育诱导激活,两个受成株期生长发育诱导激活,苗期和成株期各有3个受病原菌诱导激活。苗期生长发育诱导激活产生的逆转座子数目高于成株期,而病原菌诱导产生的逆转座子数目与成株期相当,表明水稻白叶枯病成株抗性可能与生长发育诱导的逆转座子激活相关。     

bFGF不能调节人结膜下Tenon's囊成纤维细胞表型改变

探讨了碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）能否对人结膜下Tenon’S囊成纤维细胞（human subconjunctival Tenon＇s capsule fibroblast,HTCF）表型改变起诱导作用。在5例白内障手术中取人结膜下Tenon＇s囊组织块培养成纤维细胞。用不同浓度bFGF（0、5、10、20ng／ml）诱导HTCF 48 h。免疫细胞化学技术、蛋白质印记免疫技术检测其平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）表达与正常HTCF有否差异。实验结果表明用不同浓度（0-20ng／ml）bFGF诱导HTCF48h,虽能明显促进HTCF细胞的生长,但均不能上调细胞内α-SMA的表达。在0-20ng／ml范围内,体外用bFGF诱导HTCF48h,不能诱导其改变为肌成纤维细胞。     

siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率

在动物细胞中,抑制非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复途径,可以提高同源重组(Homologous recombination, HR)修复基因组双链断裂(Double-strand brakes, DSBs)的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的HR效率,针对NHEJ修复途径中的关键因子Lig4(DNA ligase 4)基因,本文设计合成4个具有靶向性的siRNA(Small interfering RNA)。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入siRNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测,筛选出有效抑制Lig4基因表达的2个siRNA。应用质粒重连法检测HR修复效率,将I-SceⅠ酶线性化的HR质粒和siRNA共转染绵羊胚胎成纤维细胞,经72 h培养及流式细胞仪检测,与对照组细胞比较,结果表明HR质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰Lig4基因的表达可提高HR质粒重连效率,为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。     

miR-223促进小鼠胚胎成纤维细胞复制性衰老

微小RNA（MicroRNAs（或miRNAs）是作为强大的基因表达调控子,广泛参与多种生命过程,在细胞衰老进程中的作用也日益受到关注。miR-223是一个典型的抑癌基因,可显著抑制细胞增殖能力。此外,miR-223与阿尔茨海默症、心血管疾病以及类风湿性关节炎等衰老相关疾病的发生发展密切相关。尽管如此,miR-223在细胞衰老进程中的作用及其分子机制尚未见报道。本研究通过连续传代建立了小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）的复制性衰老模型,并利用荧光定量qRT-PCR检测发现,miR-223在衰老MEF细胞中的表达水平显著上调。随后,通过转染miR-223模拟物Agomir-223在MEF细胞中过表达miR-223,结果显示过表达miR-223可显著促进MEF细胞的衰老表型并抑制其增殖能力,而抑制miR-223的表达可延缓MEF细胞的复制性衰老进程。进一步利用生物信息学方法预测获得多个miR-223的候选衰老相关靶基因,包括Rasa1、Ddit4和Smad1等。然而双萤光素酶报告系统结果显示,miR-223并不显著影响其萤光强度,表明它们很可能并不是miR-223的下游靶基因。综上所述,miR-223可显著促进MEF细胞复制性衰老,然而其调节细胞衰老进程的分子机制依然有待深入研究。     

人工核酸酶介导的基因组编辑技术

传统的基因组编辑技术是基于胚胎干细胞和同源重组实现生物基因组定向改造,但是该技术打靶效率低,严重制约了生命科学以及医学的研究.因此,研究新的基因组编辑技术十分重要.人工核酸酶介导的基因组编辑技术是通过特异性识别靶位点造成DNA双链断裂,引起细胞内源性的修复机制实现靶基因的修饰.与传统的基因组编辑技术相比,人工核酸酶技术打靶效率高,这对于基因功能的研究、构建人类疾病动物模型以及探索新型疾病治疗方案有着重要的意义.人工核酸酶技术有3种类型：锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子核酸酶(TALEN)及规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR).本文将对以上3种人工核酸酶技术的原理以及在生命科学和医学研究的应用进行综述.     

人参皂苷Rg1促进人牙周膜干细胞增殖及骨向分化

人参皂苷Rg1 (GS Rg1) 是人参的主要药理活性成分. GS Rg1有刺激造血干细胞的形成和促进骨髓间充质干细胞增殖和分化的作用.而人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs）具有自我更新和多向分化的干细胞特性.但目前关于GS Rg1能否促进牙周膜干细胞增殖和分化的研究尚不多见.本研究证明,1×10-5 mol/L GS Rg1作用于hPDLSCs后,能明显促进牙周膜干细胞的增殖与分化.MTT检测细胞增殖显示,培养液中加入了GS Rg1实验组在第2,3,4,5 d增殖情况明显高于对照组,提示GS Rg1成分促进了牙周膜干细胞的增殖. 检测ALP表达量,RUNX2,Collagen I,OPN,OCN表达水平,加药实验组表达水平均高于未加药对照组,它们的表达量的增高提示成骨分化的增强. 牙周膜干细胞与纳米羟基磷灰石支架结合的电镜图片及其支架植入小鼠体内后的免疫组化检测显示,含有GS Rg1成分的细胞支架能促进形成更多的骨样组织.因此,GS Rg1能促进hPDLSCs体内体外的增殖及骨向分化,并在替代传统生长因子应用于牙周组织工程方面有较好前景.