人松弛素原样蛋白H2在大肠杆菌中的表达、分离纯化及鉴定

利用聚合酶链式反应方法 ,从含有人前松弛素原cDNA基因的质粒 pMALp2X-hRLXH2上得到人松弛素原H2的编码基因 ,亚克隆到温度诱导型原核表达载体pBV2 2 0上 ,转化大肠杆菌DH5α细胞。经 4 2℃温度诱导 ,获得了目的基因的高效表达。目的蛋白质以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞中。菌体经过超声波破碎 ,包含体裂解 ,蛋白质的体外变性还原 ,复性 ,SephadexG 75凝胶过滤层析 ,反相快速蛋白质液相层析等一系列分离纯化过程 ,得到了高纯度的重组Met 人松弛素原样蛋白H2 ,得率约为 2～ 3mg/L。对纯化的目的蛋白质进行了SDS PAGE电泳纯度分析 ,氨基酸组成分析 ,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测得目的蛋白质的分子量为 183 90 .4 (理论计算值为 183 92 .3 )。     

醋酸纤维素膜为基础的葡萄糖生物传感器的研制

用共价法将酶固定在醋酸纤维素膜上,方法简便易行,制造的酶膜稳定,比活力高。同时采用该方法制备了葡萄糖氧化酶酶膜,与氧电极组装成测定葡萄糖的生物传感器,线性范围为50~800mg／dl,仪器工作的最适pH为6．0,最适温度为40℃。将该膜与过氧化氢电极组装得到的传感器具有以下特性：线性范围为10~200mg／dl,最适pH为6．0,测定结果与酶试制盒有良好相关性。     

兔防御素NP-1基因在转基因番茄中表达的初步研究

兔防御素ＮＰ－１是α－防御素的一种,含３３个氨基酸残基。最初从兔子的多形核嗜中性细胞中分离出来。它对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分枝杆菌、真菌、被膜病毒以及ＨＩＶ病毒都有不同程度的抑制作用。兔防御素ＮＰ－１所带阳离子较多,可抗不具代谢活性的靶细胞。实验中将兔防御素ＮＰ－１基因构建到植物表达载体中,通过根瘤农杆菌介导转入番茄,得到了转基因番茄植株。对转基因番茄植株进行了ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交、Ｎ     

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌a-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌a-溶血素蛋白为研究对象, 分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物, Bradford法测定蛋白含量, 兔红细胞测定半数溶血效价。结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带, 达电泳级纯度。与此同时, 凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%, 蛋白含量为0.337 mg/mL, 溶血活性为1519 HU/mg; 镍柱亲和层析的纯化率为17.5%, 蛋白含量为0.35 mg/mL, 溶血活性为1463 HU/mg。由此可见, 凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。     

TAT-凋亡素融合蛋白的表达及其抗肿瘤活性

凋亡素(apoptin)由鸡贫血病毒vp3基因编码,能特异地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞 没有毒性,为了获得可转导入细胞内部的凋亡素,将人工合成的编码TAT蛋白转导结构域的DNA片段与凋亡素编码基因克隆入质粒pET-28a内,构建出表达融合蛋白TAT-apoptin的原核表达载体pET-28a-TAT-apoptin.在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达融合蛋白,利用IDA -Ni2+ 亲和柱纯化,葡聚糖凝胶G 25除去尿素后得到可溶的变性蛋白.纯化后的TAT apoptin加入体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人肺癌Anip973细胞,对照组加入TAT-麦芽糖结合蛋白（TAT-MBP）. 经免疫组化检测,转导1 h后TAT-MBP分布于以上两种细胞的胞浆和胞核,TAT-apoptin则主要分布于2种细胞的胞浆内,转导24 h后TAT-MBP的亚细胞定位没有变化,TAT-apoptin分别定位于HUVECs的胞浆和Anip973的胞核中.脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）显示转导48 h后,TAT-MBP处理过的 HUVECs和Anip973细胞、TAT-apoptin处理过的HUVECs没有明显改变,而TAT-apoptin处理过的Anip973细胞大量凋亡.以上结果表明TAT apoptin融合蛋白在肿瘤治疗上有潜在的应用价值.     

不同植物防御素的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的花生、鹰嘴豆、合欢、车前草、沙梨、辣椒等植物的防御素的核酸和氨基酸序列作了分析,并对其组成成分、翻译后修饰、导肽、跨膜结构域、疏水性,亲水性、蛋白质二级结构和功能结构域进行预测和推断的结果表明：此类蛋白可能是一具有信号肽的分泌型蛋白,α-螺旋和不规则卷曲是蛋白质二级结构中量最大的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,包含一个gamma-thionin功能结构域。     

非洲菊亲环素家族基因GCyP的克隆与生物信息学分析

亲环素(Cyclophilins,CyPs)具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,催化蛋白质折叠过程,并且起着分子伴侣的作用,同时参与mRNA加工和信号转导等生物学过程.本研究在抑制性消减杂交获得表达序列标签(EST)的基础上,通过生物信息学方法获得了非洲菊亲环素家族基因GCyP的cDNA.进而设计特异引物,以非洲菊舌状花为材料,通过RT-PCR扩增并经T-A克隆后测序,获得一条长度为732 bp的序列.该序列经生物信息学分析确认其为GCyP,编码的GCyP含172个氨基酸残基,属于单结构域胞质型亲环素.GCyP序列提交GenBank后接收,登录号为EU1269167.     

鲍肽素对血管性痴呆大鼠学习与记忆能力的干预及机制研究

目的：观察鲍肤索对血管性痴呆大鼠学习与记忆能力的干预及机制。方法：制备生物鲍肤索,分剂量喂饲血管性痴呆大鼠,测试学习与记忆能力、红细胞和血红蛋白。结果：鲍肤素提高大鼠Y型迷宫测试的分值和红细胞、血红蛋白水平。结论：鲍肤素能提高血管性痴呆大鼠的学习与记忆能力和红细胞、血红蛋白水平。     

人脂皮素-1cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

脂皮素1(LC1)是钙依赖性的膜磷脂结合蛋白,介导糖皮质激素的抗炎作用。本研究采用RTPCR法获取人LC1cDNA,以pUC18为克隆载体、pBV220为表达载体,在DH5α菌成功表达了LC1,免疫印迹实验证实了重组蛋白的免疫活性 。     

用生物素标记结核菌单克隆抗体检测脑脊液结核菌抗原的研究

应用生物素标记结核菌单克隆抗体酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)检侧脑脊液结核菌扰原,并在同一滴定板上与常规ELISA比较。结果表明在85.4%的脑脊液中,BA-ELISA较常规ELiSA敏感,抗原滴度为后者的2.5倍。本法阳性率为88.5%,明显高于常规ELISA法(p<0.05),而其非特异性却无明显增加,提示本法为结核性脑膜炎的免疫学诊断提供了一种比常规ELISA更为敏感的新方法。