石榴木质素合成相关基因PgMYB308的克隆和表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatumcv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,获得与木质素的合成相关基因PgMYB308。PgMYB308基因cDNA全长792bp,编码263个氨基酸。分子量为29.56kD,理论等电点为9.07。序列比对和功能域分析发现,PgMYB308包含R2和R3保守域,以及C1、C2、C4和锌指基序。系统进化树分析显示,PgMYB308与其他物种起源相同,而与桉树EgMYB308亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,PgMYB308在茎、叶和种子等组织中均有表达,其中茎中表达量最高,叶片中表达量最低;PgMYB308在‘突尼斯软籽’中表达最高,而在‘红玉石籽’和‘白玉石籽’中表达量较低;PgMYB308在‘红玉石籽’籽粒的不同时期均有表达,但在花后20d相对表达量最高,以后随发育进程呈现逐渐下降的趋势。     

家鸡G蛋白偶联受体161的基因克隆、分子进化和组织表达

G蛋白偶联受体161(GPR161)是G蛋白偶联受体家族孤儿受体家族成员,在哺乳动物晶状体发育调节和神经胚形成中具有重要作用。近年来研究发现该蛋白罕见地拥有类似支架蛋白的结构特征,暗示其信号转导机制不同于其他G蛋白偶联受体。本研究以家鸡Gallus gallus为动物模型,探究GPR161基因序列信息、分子遗传进化关系以及其组织表达图谱。家鸡GPR161基因编码区序列全长1 566 bp,编码具521个氨基酸的前体蛋白。序列分析显示,家鸡GPR161基因编码区与人Homo sapiens、小鼠Mus musculus、斑马鱼Danio rerio的氨基酸相似度分别为83.0%、82.6%、65.8%。分子进化遗传分析结果显示,GPR161基因在家鸡与斑马鱼的进化关系比家鸡与人或小鼠都更为疏远。利用荧光定量PCR探究家鸡GPR161基因在各组织的表达分布,结果显示,家鸡GPR161基因mRNA在精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉中有较高表达。本研究是鸟类中关于GPR161基因的首次报道,研究结果为进一步探究GPR161基因在鸟类中的生理效应提供参考。     

Burkholderia cepacia胆固醇酯酶及其分子伴侣基因的串联表达及酶学性质的研究

为实现胆固醇酯酶的可溶性表达,以Burkholderia cepacia ST-200胆固醇酯酶为研究对象,将酶及其分子伴侣通过人工添加的SD序列在大肠杆菌中进行串联表达。通过SDS-PAGE电泳分析,胆固醇酯酶成功获得可溶性表达,摇瓶水平的总酶量为1 077 U/L。经过镍柱纯化之后可以获得一条相对分子量约为37 kDa的单一条带。利用圆二色谱解析胆固醇酯酶的二级结构,并测定Tm值,从最适温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性及有机溶剂耐受性等方面对胆固醇酯酶进行研究,结果表明该酶在pH为7.0,45℃条件下表现出最大活力。     

乳酸菌表达CRISPR gRNA载体的构建与鉴定北大核心

[目的]构建并筛选重组gRNA(向导RNA)表达质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX,并对gRNA在乳酸菌中的表达进行鉴定。[方法]通过PCR技术扩增复制子SH71、氯霉素抗性基因CM和gRNA表达盒片段。将CM片段分别与gRNA表达盒进行融合,再与SH71复制子进行无缝克隆。通过转化,构建重组质粒p SJCR-LDH和p SJCR-C9PX。应用PCR、RT-PCR、Real-Time PCR对重组质粒进行鉴定,gRNA表达验证及拷贝数检测。[结果]PCR及RT-PCR结果显示获得169 bp大小目的条带,表明获得重组质粒载体且该gRNA表达载体在植物乳杆菌WCFS1株、CGMCC1.557株、乳酸乳球菌MG1363株中均成功表达,绝对荧光定量PCR检测获得LDH-gRNA标准曲线为y=-3.480log X+45.34,扩增效率为93.8%;C9PX-gRNA标准曲线为y=-3.327log X+37.07,扩增效率为99.8%。[结论]为利用CRISPR基因编辑技术在乳酸菌中进行基因操作奠定基础,为乳酸菌载体构建提供方法。     

植物质膜水通道蛋白转运及逆境胁迫响应的分子调控机制

质膜水通道蛋白即质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs),属于通道蛋白,定位在质膜上,是植物体内水分子、CO₂及其他一些小分子溶质跨细胞膜运输的通道。PIPs对运输基质具有高度选择性,在维持植物细胞的水分平衡过程中发挥重要作用。PIPs的表达、活性与定位不但受转录水平和翻译后水平的调控,而且受外界环境影响。研究表明在非生物胁迫下,PIPs表达模式和定位会发生改变。本文重点阐述了PIPs转运的分子机制、转录水平及翻译后水平的调控机制以及PIPs对非生物胁迫的响应机制,分析了目前关于PIPs的研究动态和值得探究的研究方向,以期帮助相关领域的科研人员对PIPs的研究进展有更深入地了解。     

重组中华仓鼠卵巢细胞培养过程控制的研究进展

中华仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CHO)是科研及生产中用于蛋白表达的常用体系。与大肠杆菌相比,CHO获得高表达的细胞株所需时间更长,蛋白产量更低。因此,大规模培养细胞所需的成本较高,培养条件也不易掌握。但该体系产生的蛋白纯度高,因而被广泛用于工业生产中。本文对CHO细胞的培养方式、pH值测定、渗透压、溶氧及培养液成分的选择等多方面条件进行综述,为优化中华仓鼠卵巢细胞培养的策略及具体方法提供理论依据。     

烟粉虱MED隐种气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA克隆及原核表达

采用RT-PCR和RACE技术成功克隆烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因BtabOBP2和BtabOBP4的cDNA全长。BtabOBP2(Gen Bank登录号:AIS71883)和BtabOBP4(Gen Bank登录号:AIS71884)的cDNA序列全长分别为1107 bp和874 bp,完整开放阅读框(ORF)分别为744 bp和429 bp,分别编码247和142氨基酸,BtabOBP4有6个保守的半胱氨酸,属于典型OBP,而BtabOBP2除了具有典型OBP的6个半胱氨酸,增加了3个保守的半胱氨酸,属于Plus-C OBP。将得到的BtabOBP2和BtabOBP4重组到原核表达载体pET30a(+),转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,用IPTG诱导融合蛋白表达。采用亲和层析和凝胶过滤层析纯化融合蛋白,并进行Western blot分析。结果显示,BtabOBP2和BtabOBP4融合蛋白在大肠杆菌中均有可溶性表达,Western blot结果证实所表达的融合蛋白确实为目的蛋白。BtabOBP2融合蛋白在SDS-PAGE中的表观分子量比预测的分子量大了6.53 k Da,用重组肠激酶切掉6×His标签后,目的蛋白的表观分子量与预测分子量相近,偏差降低,说明6×His标签是造成融合蛋白表观分子量偏差的原因。本研究明确了烟粉虱气味结合蛋白基因BtabOBP2和BtabOBP4的核苷酸、氨基酸序列特征,并成功进行了原核表达和纯化,为进一步研究这两个OBP基因的分子结构和功能奠定了基础。     

人白血病抑制因子在原核细胞中的表达与纯化

研究证明人白血病抑制因子(hLIF)是一种对多种不同类型的细胞和组织具有重要功能的细胞因子,其独特的生物学特性使其被广泛应用。介绍了自制的具有生物活性的hLIF,将hLIF基因克隆到pET32a中,并利用硫氧还蛋白(Trx)作为融合配体,在大肠杆菌中成功表达可溶性融合蛋白Trx-hLIF。亲和层析纯化后利用SDS-PAGE和Western blot对纯化结果进行检验。利用肠激酶(EK酶)切割融合蛋白,释放hLIF,随后通过简单的阳离子交换得到纯度高达98.1%的hLIF4.75mg。小鼠M1髓系白血病细胞增殖分析测定纯化的rhLIF的功能与hLIF具有相似的生物活性,EC50为5ng/ml,对应的比活性为0.5×107 IU/mg。     

同源过表达BglR对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性的影响

目的:克隆嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)bglr基因,构建Mtbglr过表达载体,研究同源过表达bglr对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性及总纤维素酶活性的影响。方法:利用SLIC技术构建Mtbglr过表达载体;使用MtPpdc启动子及MtTpdc终止子将该基因进行同源过表达;利用原生质体转化、实时荧光定量PCR和酶活测定等技术实现bglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。结果:成功构建Mtbglr过表达载体,并转化嗜热毁丝霉,结果表明,诱导培养条件下,转化子Mt8菌株的β-葡萄糖苷酶活性和胞外蛋白质浓度分别是WT菌株的1.7倍和1.9倍。结论:bglr基因对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性具有增强作用,为嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因调控奠定了理论基础。     

溶葡球菌酶高效表达与应用

溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)是采用基因克隆技术使溶葡球菌酶基因实现外源表达所产生的蛋白质。它是Zn2+依赖的金属蛋白酶,具有肽链内切酶活性,能专一性地水解葡萄球菌细胞壁Gly五肽桥联,使金黄色葡萄球菌(特别是MRSA)细胞壁破裂,达到溶菌杀菌作用,而不产生耐药性。作为一种抗菌剂,在兽药与临床等领域具有巨大的应用潜力。综述对溶葡球菌酶的来源、作用机制、不同表达系统及前景与展望进行综述。