重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略

大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。     

番茄ARF2蛋白的生物信息学分析与亚细胞定位

克隆番茄(Solanum lycopersicum) ARF2基因,并分析其分子特性和亚细胞定位,为研究其功能提供基础．通过生物信息学方法分析SlARF2基因编码蛋白的理化性质和分子特性．采用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增SlARF2基因全长,并构建与黄色荧光蛋白(YFP)融合的pBA-ARF2-YFP表达载体,进而再通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化到野生型番茄中,将得到的T1代转基因种子萌发,然后取根尖通过荧光显微镜观察了融合蛋白在活细胞内分布的特点．生物信息学分析结果表明,SlARF2是富含Ser、Leu、Gly和Pro以及具有ARF家族典型结构域的可溶性蛋白,其氨基酸序列与葡萄、木薯和拟南芥的同源性分别为70.08 %、66.94 %和60.87 %．经酶切和测序分析证实pBA-ARF2-YFP融合表达载体构建成功,此外,PCR分析表明融合蛋白在转基因植株中得到表达．经荧光显微镜观察,ARF2定位在细胞核中．表明转录因子SlARF2定位在细胞核中,对番茄果实发育和成熟起重要作用．     

烟草甲细胞色素P450还原酶基因的分子特征与表达模式分析

烟草甲Lasioderma serricorne是一种重要的仓储害虫,长期化学防治导致烟草甲已对多种传统熏蒸剂产生抗性,但其对新型熏蒸剂甲酸乙酯仍处于敏感水平。因此明确其体内细胞色素P450还原酶（cytochrome P450 reductase, CPR）对甲酸乙酯的代谢解毒功能,对开展该药剂的抗性监测及延缓抗性的发生发展具有重要意义。本研究旨在克隆烟草甲LsCPR基因,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在烟草甲对甲酸乙酯解毒代谢过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术克隆烟草甲LsCPR基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）;利用生物信息学软件分析LsCPR编码蛋白的结构、特征和系统进化关系。采用实时定量PCR技术检测LsCPR在烟草甲不同发育阶段（低龄幼虫、高龄幼虫、蛹、低龄成虫、高龄成虫）、幼虫不同组织（表皮、肠道、脂肪体和马氏管）以及甲酸乙酯熏蒸胁迫后的表达模式。烟草甲LsCPR基因的ORF为2 046 bp（GenBank登录号：MZ423209）,编码681个氨基酸,具有典型的昆虫CPR基因FMN区域、NADPH区域和FAD等保守结构域。系统发育分析表明,烟草甲LsCPR与鞘翅目昆虫聚为一支,且与赤拟谷盗Tribolium castaneum CPR亲缘关系最近。LsCPR在烟草甲不同发育阶段均有表达,在高龄幼虫期的表达水平较高;在幼虫体内的表达部位主要在肠道,其次为脂肪体和马氏管,而在表皮的表达水平最低。LC10、LC30和LC50 3种浓度的甲酸乙酯处理24 h后,烟草甲LsCPR表达量随着胁迫浓度升高而上调且显著高于对照;甲酸乙酯LC50处理烟草甲不同时间（3、6、12、24和48 h）后,LsCPR基因上调表达,24 h时达到表达高峰。推测LsCPR是参与烟草甲代谢甲酸乙酯的候选基因。     

管氏肿腿蜂毒液过敏原3基因的克隆及表达分析

为研究管氏肿腿蜂Scleroderma guani毒液过敏原3基因SgA3的功能,通过RT-PCR克隆SgA3基因,采用荧光定量PCR分析其在不同发育阶段和组织中的表达特征,并利用载体pSUMO-Mut对其进行原核表达。克隆获得SgA3基因开放阅读框长699 bp,编码233个氨基酸,其中信号肽位于N端第1~23位氨基酸。多序列比对分析发现,SgA3与丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis、粉蝶盘绒茧蜂Cotesia glomerata、红火蚁Solenopsis invicta和常见黄胡蜂Vespula vulgaris过敏原3的氨基酸序列一致性分别为50.44%、50%、48.89%和47.83%。荧光定量PCR结果表明,SgA3基因在雌成虫中高表达,且在毒液器官中的表达量显著高于雌成虫其他组织和雄成虫中的表达量。利用pSUMO-Mut表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的SgA3重组蛋白。该研究结果为进一步研究SgA3基因的功能奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌的cry2A芽孢期启动子和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa蛋白表达的影响

[目的]分析苏云金芽孢杆菌的cry2A型芽孢期启动子对晶体蛋白Cry11Aa的协调作用和分子伴侣ORF1-ORF2对Cry11Aa表达的促进功能.[方法]3个包括cry11Aa编码区的重组质粒pHcy1、pHcy2和pHcy4被构建并电激转化到苏云金芽孢杆菌晶体缺陷株4Q7中,其中pHcy1质粒携带cry11Aa基因自身启动子和分子伴侣p19基因,pHcy2携带cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因,pHcy4质粒在pHcy1的上游插入了cry2A型芽孢期启动子和分子伴侣orf1-orf2基因.SDS-PAGE分析了Cry11Aa蛋白在各重组苏云金菌株中的表达情况,并通过生物测定确定了其对蚊虫的生物活性.[结果]SDS-PAGE结果表明,Cry11Aa蛋白在4Q7(pHcy1)和4QT(pHcy4)均获得了表达,在4Q7(pHcy2)中未检测到Cry11Aa蛋白,推测晶体蛋白Cry11A不能利用cry2A型启动子进行表达调控;Cry11Aa蛋白在等体积4Q7(pHcy4)培养液中的表达量是4Q7(pHcy1)菌株的1.25倍,暗示着分子伴侣ORF1-ORF2在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量.4Q7(pHcy1)和4Q7(pHcy4)形成的Cry11Aa蛋白晶体的形状和大小相似,两者对致倦库蚊的生物活性没有明显差异,LC50s分别为59.33 ng/mL和66.21 ng/mL,.[结论]推测晶体蛋白Cry11A能否成功表达与其使用启动子的类型和两者的协调配合有关.分子伴侣ORF1-ORF2虽然在某种程度上能提高Cry11Aa的蛋白表达量,但对提高Cry11Aa蛋白的杀蚊毒力没有显著性帮助.     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

基于CRISPR-dCas9转录激活系统的毛果杨ANT转录因子功能分析

基于CRISPR-dCas9的基因转录激活表达能够避免基因异位表达带来的表型干扰,同时使基因有效地特异性表达。该研究利用新型CRISPR-Act3.0表达系统,在毛果杨（Populus trichocarpa）中对维管形成层特异表达转录因子ANT(AINTEGUMENTA)进行基因转录激活,创制遗传材料,并对基因的功能进行分析。首先对毛果杨PtrANTs转录因子进行同源分析,选取其中的PtrANT-4进行后续研究,对该基因进行克隆并利用荧光定量PCR分析其在各组织中的表达情况;其次在PtrANT-4启动子上设计3条gRNAs,构建CRISPR-dCas9转录激活表达载体,利用原生质体瞬时转化法检测该载体的表达;最后将该表达载体利用农杆菌介导法转化毛果杨,获得PtrANT-4转录激活遗传材料。结果表明：毛果杨中有4个PtrANTs转录因子,选取的PtrANT-4基因CDS序列全长为2 058 bp,编码685个氨基酸,在毛果杨侧生分生组织维管形成层特异表达。基于CRISPR-Act3.0表达系统成功构建的转录激活载体,在毛果杨木质部原生质体中转化后具有激活PtrANT-4表达的作用。获得...