水稻受精前后胚囊内钙调素分布的变化:免疫金电镜观察

用胶体金免疫电镜技术观察了水稻(Oryza sativa subsp. japonica)受精前后胚囊内钙调素的分布变化.授粉后,卵细胞、助细胞和中央细胞内的钙调素较授粉前均有所增加.中央细胞内钙调素的增加要比卵细胞中约早2 h,退化助细胞与宿存助细胞之间的钙调素含量无明显差异.授粉到受精期间,钙调素的主要分布形式由分散的单颗粒转变为聚集颗粒,受精完成后再变为分散的单颗粒形式.胚囊壁及珠心细胞的细胞壁和胞间隙中也观察到钙调素的分布和数量变化.初步讨论了胞内和胞外钙调素在水稻受精与合子形成中的作用.     

植物细胞质外体多肽与蛋白研究

细胞质膜以外的质外体是植物细胞的重要组成部分, 质外体是植物细胞的重要信号源和细胞器。当植物遭受生物或非生物环境刺激时,可能首先引起质外体信号系统的变化; 同时质外体作为植物细胞之间最方便的通道, 在细胞间信号传递和信息交流上起重要作用, 从而成为协调植物细胞分化、器官形成和整体生长发育的决定性因素之一。本文概括地介绍了我室在此领域的一些研究进展。     

白菜转脂蛋白CaMBP10分子中钙调素结合结构域的鉴定

植物转脂蛋白(LTPs)是多基因编码的蛋白家族, 广泛分布于高等植物,其确切的生理功能至今仍不清楚. 本室从白菜中分离的钙调素结合蛋白-10 (CaMBP10) 经序列分析 被鉴定为植物转脂蛋白家族成员,体外实验证明钙调素(CaM)调节其脂质结合活性.为了深入了解转脂蛋白与CaM的相互作用机制,本文通过删除、缺失和定点突变等分子生物学手段确定了白菜转脂蛋白CaMBP10分子中的钙调素结合结构域.该结构域位于分子C末端 64~83位氨基酸残基之间,其中疏水氨基酸的分布具有1-5-8-10 的CaM结合模序特征.     

拟南芥钙调素结合蛋白参与胁迫响应的研究

采用实时荧光定量RT-PCR和Northern blotting技术检测了野生型拟南芥中CBP60g基因对丁香假单胞菌和非生物胁迫的响应,并对丁香假单胞菌接种后,野生型拟南芥、cbp60g-1突变体和CBP60g过表达转基因植物中抗逆相关基因的表达变化进行检测。结果显示:(1)在野生型拟南芥中CBP60g基因的表达能被丁香假单胞菌、高盐、冷和机械损伤所诱导。(2)经丁香假单胞菌诱导后病程相关基因PR5和AIG1的表达在过表达转基因植物中明显高于野生型。(3)受干旱和ABA诱导的AtMYB2基因的表达在过表达转基因植物中也高于野生型。研究表明,CBP60g同时参与了拟南芥对生物和非生物胁迫响应。     

钙调素激酶在玉米体内的免疫组织化学定位

应用免疫组织化学定位方法研究了玉米体内钙调素激酶(CaM kinase,CaMK)的表达模式。结果表明CaMK广泛分布于玉米体内,但表达水平存在着明显时空差异。在营养器官中钙调素激酶主要分布于叶的维管束鞘细胞、侧根原基和根尖等部位,而其它部位没有检测到明显的分布。在生殖器官中,有大量钙调素激酶分布于幼胚及花药小孢子母细胞、四分体及绒毡层细胞中;在成熟胚囊的卵细胞、中央细胞以及二者的分界面上也有少量分布。这些结果为进一步探索钙调素激酶在植物体内的生理功能提供了重要线索。     

心肌细胞核钙调素I介导的bcl-2转录调节在大鼠心肌肥厚中的作用

为探讨心肌细胞核钙调素I(calmodulin I,CaM I)介导的bcl-2转录调节在大鼠心肌肥厚中的作用及其可能机制, 实验随机分为对照组和心肌肥厚组,采用腹主动脉缩窄法制备大鼠心肌肥厚模型。模型复制成功后4周,以改良差速离心和密度梯度离心提取并纯化细胞核;蛋白印迹法测定心肌细胞核cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response-element binding protein,CREB)及磷酸化CREB(phosphorylated cAMP response-element binding protein,pCREB)表达;免疫组化法观察左室心肌组织CaM I蛋白表达及分布;延续转录分析法观察阻断CaM I后心肌细胞核bcl-2 mRNA的变化。结果表明,心肌肥厚组pCREB蛋白表达较对照组明显增加(P<0．05),CREB蛋白表达无明显变化(P>0．05);CaM I分布于细胞核及细胞浆,心肌肥厚组CaM I蛋白表达较对照组明显增加(P<0．05);使用CaM抑制剂后心肌细胞核bcl-2 mRNA表达明显上调(P<0．05)。结果提示,压力超负荷时心肌细胞核内CaM I激活,抗凋亡基因bcl-2表达下调,核转录因子CREB磷酸化增加,但CREB 在调节bcl-2基因转录过程中可能发挥次要作用。     

重组人钙调素的制备及其对细胞增殖作用影响的研究

用PCR方法获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢcDNA),将其插入表达载体pBV220,构建重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220,阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量与理论值相符(约17kD)的诱导表达条带.进一步分析表达产物的性质表明,CaM主要以可溶性形式表达.Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗CaMMcAb起特异反应.用Phenyl-SepharoseCL-4B疏水亲和层析法纯化重组菌超声上清表达产物,可获得纯度达95%以上的CaM,每1L菌液可获CaM纯品3～4mg.生物活性测定结果提示,rhCaM具有与标准人脑CaM(Sigma)同样的激活NAD激酶的活性.将K562细胞及SP2/0细胞分别接种于24孔或96孔培养板,加入不同浓度rhCaM、CaM拮抗剂三氟拉嗪(TFP),培养48h后,用MTI比色法检测细胞增殖状况.rhCaM在一定浓度范围内与细胞增殖率成显著正相关;CaM拮抗剂TFP可抑制细胞增殖.将rhCaM加入已受TFP抑制的细胞,可恢复正常的细胞增殖功能.     

钙—钙调素信号系统与环境刺激

植物抗逆研究已有很大进展,但传递各种外界刺激的信号通路仍未可知,目前已有一些研究发现很多环境刺激与钙－钙调素系统有关,Ca^2 信号系统是很重要的一种信号途径,CaM是目前已知的胞内Ca^2 信号受体中最重要的一种,参与了多种生理活动的调节,在热激领域中,研究者已提出Ca^2 -CaM系统可能参与了热激反应,在基因调节水平,转录水平,蛋白水平均有Ca^2 和CaM参与热激的证据,其它环境刺激也能引起植物体内Ca^2 和CaM的一系列变化,这为研究各种环境刺激可能的信号通路提供了基础和依据。