ELISA检测外用人纤维蛋白原中纤溶酶原残留量的验证及应用

目的 ELISA检测外用人纤维蛋白原中纤溶酶原残留量,并对其进行方法学验证及应用。方法按照方法学验证的要求,对专属性、线性与定量范围、样品稀释线性、准确性、精密度、耐用性、样品稳定性进行验证分析。应用该方法检测外用人纤维蛋白原主要工艺步骤样品及成品中纤溶酶原残留量,并进行分析和控制。结果专属性验证结果表明,制剂缓冲液对检测结果无干扰,准确性均在(100±10)%以内;线性和定量范围验证结果表明,在0.137～100 ng/mL定量范围内,线性相关系数(R~2)>0.99,对照品回收率均在(100±20)%内,变异系数(coefficient of variation,CV)<5%;样品稀释线性验证结果表明,将样品稀释至0.332～83.050 ng/mL范围内,准确性均在(100±20)%内,CV均<15%;准确性验证结果表明,回收率均在(100±20)%以内;精密度验证结果表明,重复性和中间精密度CV均<10%;耐用性验证结果表明,样品孵育时间缩短至2.0 h,回收率为(89.5±1.4)%,CV为1.5%;样品稳定性验证结果表明,样品室温放置6 h以内,冻融3次以内,准确性均在(100±20)%以内。用此方法检测外用人纤维蛋白原主要工艺步骤样品及成品中的纤溶酶原残留量,结果表明层析步骤去除了95.1%纤溶酶原,是控制纤溶酶原的关键步骤;3批样品纤溶酶原残留量检测结果批间CV<20%,生产工艺稳定。结论该方法线性与定量范围、样品稀释线性均达到可接受标准,专属性、准确性、精密度、耐用性、样品稳定性均良好。应用此方法检测外用人纤维蛋白原中的纤溶酶原残留量,为去除痕量纤溶酶原时提供检测分析手段,有利于人纤维蛋白粘合剂产品质量的控制。     

1株人乳头瘤病毒6型山东地方株的全基因组序列分析

人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)是引起生殖器疣与复发性喉乳头瘤的主要病原体之一.为明确2019年济南市1例尖锐湿疣患者的病毒基因组序列特征,本研究提取其尖锐湿疣组织标本总DNA,分两段进行HPV6全基因组PCR扩增和步移法Sanger测序,将拼接后的序列与全球36条不同来源的HPV6全基因组序列进行对比分析.结果 显示,1013/19/JN/CHN/HPV6株(以下简称1013/HPV6)基因组全长8031bp,属于变异谱系B1,与全球不同地区HPV6分离株序列的同源性为98.4％～99.9％.1013/HPV6株与B1亚谱系参考株AF092932全基因组序列相比具有19个核苷酸变异位点,分布在7个开放阅读框架(Open Reading Frames,ORFs)和非编码区内.本研究首次分析了分离自中国大陆的HPV6全基因序列特征,研究结果为HPV分子进化的进一步研究和分型诊断试剂的优化提供了数据.     

中国东北地区人乳头瘤病毒16型全基因组克隆及HPV16.HaCaT重组细胞模型的构建及初步鉴定

为构建含东北地区人乳头瘤病毒16型(HPV16)全基因组的HPV16.HaCaT细胞模型,收集中国东北地区HPV16单一感染患者宫颈脱落细胞,提取DNA,将HPV16全基因组分成4个区段,通过4对特异性引物对HPV16全基因组进行分段扩增,测序后进行序列拼接及核酸序列分析,克隆HPV16全基因组序列;通过细胞转染,构建含HPV16全基因组的HPV16.HaCaT重组细胞模型;利用聚合酶链式反应(PCR)和细胞免疫荧光法检测重组细胞内HPV16早期基因的表达.成功克隆出中国东北地区HPV16全基因组序列(GenBank登录号:MW320358);构建了东北地区HPV16全基因组的重组质粒及HPV16.HaCaT重组细胞模型;证明了 HPV16早期基因E1-E4、E5、E6和E7在重组细胞模型内均有表达,从而获得中国东北地区HPV16全基因组序列及含有HPV16全基因组的HPV16.HaCaT重组细胞模型.     

磁共振成像检查联合血清HE4、TK1、CA199检测在卵巢癌诊断中的应用价值

摘要 目的：研究磁共振成像（MRI）检查联合血清人附睾蛋白4（HE4）、细胞质胸苷激酶（TK1）、糖类抗原199（CA199）检测在卵巢癌诊断中的应用价值。方法：将2017年4月～2019年12月我院收治的卵巢癌患者54例作为卵巢癌组,卵巢良性肿瘤患者49例作为卵巢良性肿瘤组,所有受试者均进行MRI检测,并采集受试者血清检测HE4、TK1、CA199水平,以受试者工作特征（ROC）曲线分析MRI检查联合血清HE4、TK1、CA199检测诊断卵巢癌的效能。结果：卵巢癌MRI特点包括以下几点：①囊实性肿块;②形态不规则;③呈长T2/T1等信号;④病灶边界模糊;⑤增强扫描结果呈病灶显著强化;⑥腹膜转移者存在显著腹腔积液以及散在分布的结节状种植病灶。卵巢良性肿瘤MRI特点包括以下几点：①囊壁光滑;②呈长T1以及长T2信;③病灶边界清晰;④增强扫描结果提示病灶无强化/稍有强化。卵巢癌组血清HE4、TK1、CA199水平分别为（87.13±15.32）pmol/L、（2.15±0.13）pmol/L、（95.39±15.25）U/mL,明显高于卵巢良性肿瘤组的（66.42±10.19）pmol/L、（0.85±0.20）pmol/L、（37.94±1.05）U/mL（均P＜0.05）。经ROC曲线分析可得：MRI检查联合血清HE4、TK1、CA199检测诊断卵巢癌的灵敏度、特异度以及曲线下面积均高于上述各项单独诊断。结论：卵巢癌患者血清HE4、TK1、CA199水平较高,MRI检查联合血清HE4、TK1、CA199检测诊断卵巢癌的价值较高,具有一定的临床应用价值。     

敲低去泛素化酶USP13抑制K562细胞的增殖*

目的:研究去泛素化酶USP13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响,并进行初步的机制探究。方法:构建pLKO.1-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体,慢病毒包装后感染并建立稳定敲低USP13的K562细胞株。免疫印迹检测K562细胞中USP13蛋白的敲低效率。流式细胞术分析敲低USP13对K562细胞增殖和凋亡的影响。免疫共沉淀和蛋白质泛素化实验探究USP13调控K562细胞的分子机制。结果:成功构建pLKO.1-shUSP13-GFP慢病毒干涉载体,同时利用慢病毒体系获得稳定敲低USP13的K562细胞株。流式细胞术结果显示,敲低USP13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖。分子机制研究发现,敲低USP13通过增强c-Myc泛素化进而导致其蛋白质水平降低。结论:初步揭示了USP13调控K562细胞增殖和凋亡的分子机制,为治疗慢性髓系白血病提供了潜在的靶点。     

右旋氯胺酮对大鼠脊髓损伤后BDNF和炎症反应的影响

摘要 目的：探讨脊髓损伤后,使用右旋氯胺酮对BDNF和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13表达的影响。方法：将60只成年雄性大鼠随机分入5组,损伤组（A组）5 mg/kg右旋氯胺酮组（B组）、10 mg/kg右旋氯胺酮组（C组）和20 mg/kg右旋氯胺酮组（D组）,假手术组（S组）,每组12只。除S组外,其余4组使用脊髓打击法制备脊髓损伤模型,于脊髓损伤后4 h按照相应的给药剂量以5 mL/h的速度泵注右旋氯胺酮,S组仅进行手术操作,不损伤脊髓,手术后4h以相同的方法泵注等量的0.9 %氯化钠溶液。脊髓损伤后7、14、21和28天使用BBB法进行神经功能缺陷评分。采用HE染色法观察脊髓损伤后存活的神经元数量,ELISA法测定BDNF、Trk B、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13、的表达水平。结果：与S组比较,其余四组BBB评分升高,存活神经元数量减少,BDNF、TrkB表达显著增加,促炎因子TNF-α、IL-1β表达上调,抑炎因子IL-10、IL-13表达均显著下调（P<0.05）;与A组比较,B组大鼠BBB评分、神经元数量、BDNF、TrkB、炎症因子的表达无明显差异（P>0.05）,C组、D组大鼠BBB评分升高,存活神经元数量减少,BDNF、TrkB表达增多,促炎因子TNF-α、IL-1β上调,抑炎因子IL-10、IL-13表达下调,且差异有统计学意义(P<0.05),C组与D组以上指标差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：脊髓损伤后4 h给予10或20 mg/kg右旋氯胺酮可以减轻SCI后神经元损伤,其机制与上调原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）的表达,增加BDNF含量,从而下调促炎因子IL-1β,TNF-α,上调抑炎因子 IL-10、IL-13有关,在本研究中右旋氯胺酮最佳作用剂量为10 mg/kg。     

湿润烧伤膏联合重组人碱性成纤维细胞生长因子对浅Ⅱ度烧伤患者创面肉芽组织HIF-1α、VEGF蛋白表达的影响

摘要 目的：观察湿润烧伤膏联合重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh-bFGF）凝胶治疗浅Ⅱ度烧伤患者的疗效及对创面肉芽组织缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达的影响。方法：选取天津市第一中心医院2018年12月到2020年12月之间收治的浅Ⅱ度烧伤患者70例,根据住院号单双数分为对照组和实验组两组,各35例。对照组给予rh-bFGF凝胶治疗,实验组给予湿润烧伤膏联合rh-bFGF凝胶治疗,两组均治疗2周。对比两组疗效、创面愈合率、症状消失时间、不良反应发生率、血清炎症因子水平变化和创面肉芽组织HIF-1α、VEGF蛋白表达变化。结果：实验组的临床总有效率、创面愈合率均高于对照组（P<0.05）。实验组的肿胀、疼痛、红斑、水疱、渗液症状消失时间均短于对照组（P<0.05）。治疗2周后,两组患者血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平较治疗前下降（P<0.05）,且实验组低于对照组（P<0.05）。治疗2周后,实验组患者创面肉芽组织VEGF蛋白表达水平高于对照组,HIF-1α蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）。对照组的不良反应发生率为11.43%,与实验组的5.71%对比差异无统计学意义（P>0.05）。结论：与单用rh-bFGF凝胶治疗相比,联合湿润烧伤膏治疗浅Ⅱ度烧伤患者可更好地促进创面愈合,改善患者症状,同时还可改善血清炎症因子水平及创面肉芽组织HIF-1α、VEGF蛋白表达,安全可靠。     

人成体心源间充质样细胞表型分析及向心脏谱系诱导分化潜能的研究

目的探讨成人心源性间充质样细胞 (CDMCs)的分子表型及向心脏谱系的分化潜能。方法实验分为:不同培养时间CDMCs (第3、5、7代),并以脐带间充质干细胞 (UCMSCs)为对照。分析各细胞分子表型并向心脏谱系诱导分化。显微镜观察细胞形态;计算生长倍增时间并绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析表面标志抗原表达;实时定量PCR和Western blot分别测干细胞多能分子及组织特异性分子mRNA和蛋白表达。结果采用重复测量资料方差分析、单因素方差分析和配对t检验。结果 CDMCs具有UCMSCs形态特征与增殖能力,体外培养1 ~ 7 d,与UCMSCs比较,P3、5、7代CDMCs增殖能力差异无统计学意义 (P> 0.05)。与UCMSCs相比,不同培养时间CDMCs表面标志抗原 (CD90)表达 (冻存前:97.13%±2.00%比59.87%±34.14%、38.83%±11.04%、34.77±14.78%;冻存后:99.83%±0.17%比56.00%±19.47%、47.48±11.88%、41.15±8.68%)降低(P< 0.05)。与UCMSCs相比,不同培养时间CDMCs中Rex1 (0.00±0.00比0.68±0.50、0.29±0.17、0.38±0.50)、Oct3/4 (1.00±0.02比5.28±0.78、3.88±0.95、3.63±0.34)、Nanog(1.00±0.16比7.57±4.69、5.40±3.58、5.34±0.76)以及心脏特异转录因子Nkx2.5 (1.00±0.12比30.60±22.43、19.69±9.65、8.82±4.94)、Gata4 (1.00±0.85比60467±25266、44350±25800、35067±23113)表达均增高,差异有统计学意义 (P均< 0.05)。与诱导前比较,向心肌诱导分化15 d后,不同培养时间CDMCs中cTnT蛋白表达水平 (0.40±0.13比0.98±0.16、0.38±0.18 比0.69±0.15、0.17±0.11比0.70±0.17)增高 (P< 0.05)。结论 CDMCs不仅具备部分干细胞和间充质细胞表型,还具有心脏组织特异性。其具备心脏谱系分化潜能,心肌细胞分化能力可能优于UCMSCs。     

658 nm低能量激光照射对人牙周膜细胞生物学效应的影响

目的:探讨658 nm低能量激光照射对人牙周膜细胞增殖、碱性磷酸酶活性及纤维连接蛋白合成的影响.方法:改良组织块法体外培养人牙周膜细胞.通过658 nm激光照射人牙周膜细胞,观察能量密度为1.86 J/cm2和3.72 J/cm2激光照射后不同时间点细胞增殖效应、碱性磷酸酶活性和纤维连接蛋白的变化.结果:1.86 J/cm2和3.72 J/cm2能量密度的激光照射人牙周膜细胞,可显著促进细胞增殖效应.3.72 J/cm2能量密度的激光照射可提高人牙周膜细胞碱性磷酸酶活性;能量密度为1.86 J/cm2的激光照射人牙周膜细胞72 h后,细胞中纤维连接蛋白分泌量增加.结论:658 nm低剂量激光照射可促进人牙周膜细胞增殖;适量的低剂量激光照射人牙周膜细胞可促进其碱性磷酸酶活性及纤维连接蛋白的分泌.     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。