基于滚环扩增的鸭乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

滚环扩增(RCA)是新近发展起来的一种能特异性扩增环形DNA的实验技术,自2008年以来被广泛用于HBV基因全长扩增及共价闭合环状DNA(cccDNA)耐药突变分析等研究。为了便于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)cccDNA的分析,本研究建立了基于RCA的DHBV cccDNA的检测方法。通过针对DHBV高度保守序列设计的4对RCA硫化修饰引物,以血清DHBV DNA为阴性对照,从肝组织DHBV DNA标本中扩增得到DHBV cccDNA。然后用跨缺口引物扩增RCA产物测序替代限制性内切酶切分析进行DHBV cccDNA鉴定。应用该方法检测39份携带DHBV麻鸭肝组织与血清标本结果显示:全部肝组织标本均检出DHBV cccDNA,而全部血清标本则均无DHBV cccDNA检出,表明本研究建立的基于RCA的DHBV cccDNA检测法具有良好的特异性和灵敏性。该方法的建立为应用鸭乙型肝炎病毒动物模型研究cccDNA在病毒致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效奠定了实验基础。     

连续13年稻鸭共作兼秸秆还田的稻麦连作麦田杂草种子库物种多样性变化

稻鸭共作能有效控制稻田杂草的危害, 但是它对后茬小麦田杂草的影响及其控制作用尚没有详细的报道。我们于2000-2012年对江苏丹阳稻鸭共作兼秸秆还田的有机稻麦连作田土壤杂草种子库进行了连续13年的观察实验。结果显示, 稻鸭共作兼秸秆还田的措施使看麦娘(Alopecurus aequalis)、通泉草(Mazus japonicus)、碎米荠(Cardamine hirsuta)等18种麦田主要杂草的种子库均有较大幅度的降低, 总体的降低幅度高达97%。除了Pielou指数处于小幅波动状态外, 麦田杂草群落多样性指数整体呈下降趋势。丰富度下降表明杂草种子库向种类少、多样性低的方向演变。从Bray-Curtis指数和Jaccard相似性指数也可以得到同样的结论。可见, 连续稻鸭共作兼秸秆还田能够降低下茬的麦田土壤里杂草种子密度及多样性, 控制杂草危害。     

鸭儿芹及制品中矿质元素分析

采用空气-乙炔火焰原子吸收法,测定了鸭儿芹及制品中钾、钙、钠、镁、铁、锌、锰、铜等8种矿质元素.对测定分析条件进行了实验,以氯化铯为电离抑制剂,用氯化锶消除磷对钙的干扰,盐酸浓度控制在2%以内,获得了满意效果.实验加标回收率为90.5%～108.2%,相对偏差为0.3%～0.7%,适合于植物材料中微量元素的分析测定.实验结果表明:鲜鸭儿芹中钾含量很高,达到44.774 mg/g,钙含量达到11.296 mg/g,同一元素在不同制品中含量存在明显差异.     

原位杂交检测人工感染鸭体内鸭瘟病毒的复制

鸭瘟(Duck plague,DP)是由鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)引起的鸭、鹅和天鹅的一种急性败血性传染病,发病率和死亡率甚高,是养鸭业的一大危害[1-2].     

鸭呼肠孤病毒强毒株致鸭胚原代成纤维细胞凋亡的研究

通过光镜、电镜、DNA Ladder法、流式细胞术、荧光染色对鸭呼肠孤病毒(DRV)诱导鸭胚原代成纤维细胞(DEF)凋亡情况进行检测.结果显示,光镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩,染色质浓染边移;电镜观察到细胞胞浆浓缩,细胞核染色质凝聚、部分形成凋亡小体;荧光染色结果显示,在感染后24h有激发绿色荧光的凋亡细胞出现,随着时间的推移,激发红色荧光的死亡细胞数量增多;DNA Ladder检测到感染后24～144h的DNA样品呈梯形条带;流式细胞术于感染后24h检测到凋亡细胞,其数量在72～96h达到高峰,144h开始下降.研究结果表明,DRV在DEF增殖的过程中具有诱导宿主细胞凋亡的作用.     

中国鸭IFN—γ基因的克隆与表达

鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染鸭,是研究IFN－γ在机体自然感染过程中机体与病毒的相互作用和病毒的清除机制的良好动物模型。从PHA刺激后的鸭外周血单核细胞（PBMC）中提取RNA,通过RT－PCR获得鸭IFN－γ（DuIFN-γ）cDNA基因,构建DuIFN-γ真核表达质粒,转染COS－7细胞,经细胞病变效应（CPE）抑制分析和MTT法对重组DuIFN-γ滴度进行测定。实验表明,重组DuIFN-γ能够抑制VSV感染鸭胚成纤维细胞而产生的细胞病变效应。抗－DuIFN-γ抗体,能中和这种抗病毒活性。并且,GST－DuIFN-γ融合蛋白在大肠杆菌中得到表达和进一步纯化。     

鸭各级卵泡中抑制素α和抑制素／活化素βA亚基信使RNA表达丰度的研究

采用非常灵敏的定量竞争RT朠CR技术对鸭各级卵泡中抑制素π和ρA亚基的mRNA表达丰度作了研究,发现在各级卵泡中均有此两亚基mRNA的表达,大卵泡中的π亚基表达量要高于ρA亚基.π亚基mRNA在小黄卵泡(SYF)中表达量最高,以其mRNA的平均相对丰度为1.00,则F1、F2、F3、F4/5、LWF(大白卵泡)中π亚基mRNA的平均相对含量分别为0.26±0.05、0.28±0.07、0.57±0.12、0.98±0.09、0.026±0.006.ρA亚基mRNA在F1中表达量最高,以其mRNA的平均相对丰度为1.00,则F2、F3、F4/5、SYF、LWF中ρA亚基mRNA的平均相对含量分别为0.218±0.09、0.111±0.03、0.058±0.011、0.053±0.013、0.005±0.002.结果显示,随着卵泡的增大π亚基表达量降低,ρA亚基却增加,说明在卵泡发育过程中,π和ρA亚基的表达是独立调节的,另外,ρA亚基在F1中的大量表达,说明F1可能是形成二聚体抑制素/活化素的主要场所.     

传染性法氏囊病病毒不同分离株vp2基因部分核酸序列分析

根据已报告的传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)cDNA序列,设计引物,用RT-PCR扩增CH(鸡)、DU(鸭)、GE(鹅)和SP(麻雀)四种不同源IBDV分离株的vp2基因高变区.核酸序列测定分析表明,四种不同源IBDV分离株vp2基因高变区的同源性为97%,推导编码蛋白氨基酸序列的同源性98%,两个亲水区和七肽区的氨基酸序列完全一致.本研究结果提示,自然感染IBDV的鸭、鹅和麻雀不仅可成为病毒携带者或传染源,而且在病毒变异中起一定作用.     

鸭病毒性肠炎病毒强毒株的形态发生学与超微病理学研究

应用透射电镜和超薄切片技术,研究鸭病毒性肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)CH强毒株人工感染成年鸭后,病毒在宿主细胞内的形态发生及各组织器官的超微结构变化.结果表明,感染后不同时间剖杀及发病后死亡鸭的肝、肠、脾、胸腺、法氏囊等组织器官中,均观察到典型的疱疹病毒粒子.病毒主要的靶细胞为淋巴细胞、网状内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肠道上皮细胞、肠道平滑肌细胞和肝细胞等.DEV的核衣壳有空心型、致密核心型、双环型和内壁附有颗粒型四种形态,存在胞核和胞浆两种装配方式.病毒核衣壳可在核内获得皮层,通过核内膜获得囊膜成为成熟病毒;也可通过内外核膜进入胞浆,在其中获得皮层,然后在各种质膜上获得囊膜,最后成熟病毒释放到细胞外.伴随着病毒的复制、装配和成熟,细胞中出现多种核内和胞浆包涵体、核内致密病毒核酸颗粒、微管和中空短管以及胞浆内膜包裹的电子致密小体、双层管等病毒相关结构.超微研究表明,组织细胞有坏死和凋亡两种变化.坏死细胞肿胀甚至破裂,线粒体肿胀空泡化,粗面内质网扩张,核糖体脱落,有的细胞器甚至完全崩解,染色质或固缩或溶解.凋亡细胞则染色质聚集,胞浆凝聚深染,细胞膜上有大量空泡,并有凋亡小体形成.细胞坏死与凋亡往往同时存在,疾病发生过程中,脾、胸腺、法氏囊以及小肠固有层中的淋巴细胞凋亡数量明显增多.     

鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌和体的制备

探索了鸡胚12～17期血液中的原始生殖细胞(PGCs)迁移数量变化规律,将其在液氮中冷冻保存.并以Ficoll密度梯度离心、MiniMACS磁气分离、滤膜三种方法对PGCs进行分离,结果发现12～17期血液中均有PGCs存在,13期达到高峰约47.1±10.5个/μl,在血液中比例为0.0126%.冷冻保存3个月后解冻成活率达80%以上.三种分离方法所得的分离效果分别为95.7%、39.2%、63.0%,纯度为27.5%、8.4%、3.1%.将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至14～15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌和体,获得8只雏鸭(8/110).以鸡W染色体探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞,嵌和率达84.2%(16/19).表明鸡原始生殖细胞能够迁移定居到鸭胚性腺中,并有可能增殖分化成有功能的配子.