全文获取类型
收费全文 | 5544篇 |
免费 | 340篇 |
国内免费 | 1971篇 |
出版年
2024年 | 32篇 |
2023年 | 88篇 |
2022年 | 133篇 |
2021年 | 149篇 |
2020年 | 118篇 |
2019年 | 147篇 |
2018年 | 132篇 |
2017年 | 154篇 |
2016年 | 147篇 |
2015年 | 197篇 |
2014年 | 352篇 |
2013年 | 256篇 |
2012年 | 279篇 |
2011年 | 344篇 |
2010年 | 266篇 |
2009年 | 342篇 |
2008年 | 425篇 |
2007年 | 302篇 |
2006年 | 333篇 |
2005年 | 328篇 |
2004年 | 366篇 |
2003年 | 311篇 |
2002年 | 324篇 |
2001年 | 285篇 |
2000年 | 226篇 |
1999年 | 228篇 |
1998年 | 191篇 |
1997年 | 147篇 |
1996年 | 156篇 |
1995年 | 175篇 |
1994年 | 123篇 |
1993年 | 99篇 |
1992年 | 121篇 |
1991年 | 127篇 |
1990年 | 85篇 |
1989年 | 98篇 |
1988年 | 43篇 |
1987年 | 44篇 |
1986年 | 32篇 |
1985年 | 65篇 |
1984年 | 31篇 |
1983年 | 17篇 |
1982年 | 14篇 |
1981年 | 20篇 |
1980年 | 1篇 |
1979年 | 1篇 |
1963年 | 1篇 |
排序方式: 共有7855条查询结果,搜索用时 390 毫秒
991.
【目的】基因敲除技术是研究基因功能的重要手段。我们试图建立一种快速、高效的大肠杆菌基因敲除方法。【方法】利用大肠杆菌(Escherichia coli)BW25113单基因缺失体Keio文库,将经典的Red同源重组技术与P1噬菌体转导技术相结合,对E.coli MG1655脂肪酸代谢基因进行快速敲除。【结果】获得了大肠杆菌β-氧化途径的缺失菌株△fadD、△fadE和△fadD-△fadE;脂肪酸合成途径缺失菌株△fabH、△fabF和△fabH-△fabF。敲除fadD和fadE对生长情况没有影响;敲除fabH后,生长速度明显减慢;敲除fabF对生长几乎没有影响。FadD、FadE及双敲缺失体的脂肪酸含量18.2 mg/L、20.0mg/L和19.2 mg/L,略高于野生型17.5 mg/L;FabH、FabF及双敲缺失体的含量分别为12.6 mg/L、15.2 mg/L和11.2 mg/L,明显低于野生型。【结论】在单基因突变体文库基础上,利用P1噬菌体转导、Red同源重组和抗性基因消除进行基因敲除,简化了构建大肠杆菌单基因和多重突变体的方法。 相似文献
992.
原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白免疫原性及免疫保护作用的研究 总被引:2,自引:1,他引:2
对原核细胞表达的肾综合征出血热病毒核蛋白的免疫原性及免疫保护作用进行了研究,结果发现表达的核蛋白具有很强的免疫原性,免疫小白鼠血清中抗肾综合征出血热病毒荧光抗体滴度达1:12800;用免疫小鼠脾细胞和血情做被动免疫保护实验,结果显示脾细胞对部分乳鼠肾综合征出血热病毒的致死感染有保护作用,保护率可达38%,而血清不具有免疫保护作用;同时也未观察到核蛋白免疫血清具有促感染乳鼠早死作用。表明核蛋白能诱导细胞免疫保护但不诱导抗体介导的免疫保护,同时也不引起抗体介导的早死,这就为肾综合征出血热病毒核蛋白作为该病毒基因工程疫苗的成分提供了一定的理论基础。 相似文献
993.
用原生质体法将含双 35S_AMV启动子及人小肠三叶因子 (hITF)cDNA的表达载体导入糙皮侧耳 (Pleurotusostreatus)中 ,原生质体转化子在含有除草剂的培养基上初步筛选 ,获得抗性菌株。通过PCR分析证明hITFcDNA已整合到侧耳基因组中。以hITF为抗原免疫家兔制备了抗血清 ,纯化后的IgG以直接型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法测定效价 ,并建立起hITF的竞争型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法 ,给出了标准工作曲线 ,以应用于大规模表达菌株的筛选确立。检测表明 ,hITF在侧耳新鲜菌丝体中分 3个表达量段 :10 0 0~ 12 5 0ng g、14 80~ 170 0ng g、最高达2 0 0 0~ 2 2 5 0ng g ,约占总可溶性蛋白的 0 7%~ 1 5 %。Western印迹进一步分析证明hITF在侧耳中的表达。 相似文献
994.
人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 总被引:10,自引:0,他引:10
The yeast Pichia pastoris was transformed by the multi\|copy Pichia expression vector that can express secreted human albumin.The high level expression of cell line was selected after screening.The expression of human recombinant albumin in Pichia pastoris induced by different methods were compared.The retio of secreted human albumin is 80% in total secreted proteins and the expression level reaches as high as is 10g/L. 相似文献
995.
利用大肠杆菌表达的重组纤溶酶原激活物抑制因子-1(rPAI-1)具有许多与天然PAI-1相同的性质,rPAI-1对u-PA抑制活性研究的内容包括:几种化学物质(盐酸胍、尿素、硫氰酸钾、SDS、氯化钠等)对rPAI-1的激活作用、盐酸胍激活rPAI-1的浓度与温度效应、显色底物法和SDS-PAGE纤维蛋白自显影对rPAI-1活性的测定、活性态rPAI-1向潜状态的转变及其与盐浓度和pH值的关系。 相似文献
996.
本实验探讨冷冻和传统中药炮制方法处理的九香虫对胃癌细胞增殖的影响及九香虫抑癌活性组分的体内分布。体外培养人胃癌SGC-7901细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)观察不同方法处理的九香虫各组分水溶液对SGC-7901细胞的体外抑制作用。结果发现,炮制九香虫蛋白浓度为50和100mg·L~(-1)时作用48h对SGC-7901细胞生长具有抑制作用,抑制率分别为13.45%和14.68%,而浓度达到200和400mg·L~(-1)时对SGC-7901细胞生长具有促进作用,抑制率为-7.94%和-82.50%;冷冻处理下九香虫不同浓度对SGC-7901细胞生长具有显著的抑制作用,该处理组蛋白浓度为50、100、200和400mg·L-1时抑制率分别为0.49%,3.82%,4.42%,39.33%。选取九香虫整虫及分解后的各部位处理组最大作用浓度比较,增殖抑制率为血淋巴腹部整虫头部。因此,冷冻处理的九香虫对胃癌细胞抑制率更高,且在该条件下九香虫的抑癌活性组分主要分布于血淋巴和腹部。 相似文献
997.
目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。 相似文献
998.
重组Pichia pastoris GS115表达碱性果胶酶的诱导阶段, 最佳初始菌体浓度和甲醇诱导浓度分别为122 g/L和20 g/L, 两者之间最佳比值范围是0.16~0.20 g/g (甲醇/菌体浓度). 在此基础上通过生长阶段甘油的指数流加, 以及诱导阶段基于甲醇比消耗速率和溶氧等参数进行甲醇流加的方式, 将甲醇与菌体浓度比例控制在0.171~0.195 g/g之间. 此时, 酶活达到430 u/mL, 生产强度为4.34 u/mL/h, 实现了碱性果胶酶高效生产。 相似文献
999.
为了在体外以人DNA拓扑异构酶Ⅰ(hTopo Ⅰ)为靶位进行抗肿瘤化合物的快速筛选,用RT-PCR法从Hela细胞中克隆了hTopo Ⅰ基因ORF并在毕赤酵母中首次成功表达,表达产物可分泌到发酵上清,易于制备。蛋白酶A缺陷的重组酵母(SMD-hTopoI)分泌重组酶的能力比具有蛋白酶A活性的重组酵母(X33-hTopoI和KMhTopoI)更高。通过发酵条件的优化,使用BMMY(pH 7.25),于20℃,每隔24h补加0.5% (V/V)的甲醇和3% (V/V)的营养液,SMD-hTopo Ⅰ诱导72h后可表达最高的酶活力(43000u/mL),发酵上清中hTopo Ⅰ可达11 mg/L,约占总蛋白的10%。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达的hTopo Ⅰ为91kD蛋白,无糖基化修饰。 相似文献
1000.