醛缩酶及其同工酶研究进展

近年来,醛缩酶的分子生物学研究进展很快。本文仅就其基因的表达呈现组织特异性并受组织发育阶段调节机制,同工酶进化规律及醛缩酶缺乏所致遗传性疾患的分子异常机制等方面的研究成果作一简要概述。     

二氢叶酸还原酶结合底物的去除

分析了应用氨甲蝶呤（MTX-Agarose）亲和层析法提纯的鸡肝二氢叶酸还原酶的组成和性质.建立了用平面粒度胶等电聚焦法去除与酶紧密结合底物的方法．讨论了结合底物对酶构象研究的影响,并指出,用未完全去除结合底物的酶研究酶在变性过程构象变化会得到错误的结论．     

2-酮-L-古龙酸还原酶分离纯化及其理化、酶学性质的研究

从发酵Ｌ山梨糖的Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ和Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ２９８０混和菌株的无细胞抽提液中分离到了２酮Ｌ古龙酸还原酶（ＫＧＲ）,测得其分子量为９０ｋＤａ。动力学性质研究表明它为一个典型的ＭｉｃｈａｅｌｉｓＭｅｎｔｅｎ氏酶,对２-酮-Ｌ-古龙酸作用的Ｋ_ｍ值为３.４２×１０^－３ｍｏｌ,最适作用ｐＨ为６.５,最适作用温度为３０℃。２-酮-Ｌ-古龙酸还原酶的合成不受Ｌ-山梨糖和２-酮-Ｌ-古龙酸的诱导,故推测２-酮-Ｌ-古龙酸还原酶是Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ的一个组成酶。     

产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76的固定化

用在有机溶剂中成型的琼脂凝胶包埋,结合戊二醛处理的方法,制备产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76固定化细胞,其细胞含量可达50%以上。固定化细胞水解青霉素 G 钾盐的最适 pH 为8.0,比原细胞约高0.3pH 单位;最适温度与原细胞一样,均为45℃。固定化后,Hg2+对酶抑制作用降低,但酶对Fe3+、Cu2+等金属离子敏感性增加。在无底物情况下,与原细胞相比,固定化细胞对 pH 和热的稳定性增加;4℃保存14个月无活力损失。固定化细胞装柱,在pH7.7,37℃下连续裂解青霉素 G,转化率达95%以上。155天无明显酶活力损失。     

山鸡椒根部精油化学成分的研究

采用水蒸气蒸馏、气相层析、标准品加入和归一法等综合技术鉴定出山鸡椒根部精油含α-蒎烯、柠檬烯、1.8-桉叶素、对聚伞花素、香草醛、甲基庚烯酮、异胡薄荷醇、香叶醇甲酸酯、α-松油醇、香草醇,柠檬醛a,b、香叶醇、丁香酚十三个成分。     

胎羊3β,20α-羟类甾醇氧化还原酶活性位点的组氨酸残基的鉴定

为进一步研究胎羊3β,20α-羟类甾醇氧化还原酶活性中心的特性,我们合成了放射性的16α-溴乙酸基孕酮和5α-二氢睾酮-17-溴乙酸酯作为亲和标记试剂。二者都是以不可逆的方式,活性位点定向地竞争性抑制酶的活性。当酶的浓度为1μmol/L,抑制剂的浓度为100μmol/L时,使酶失去一半活性所需时间(t_0.5)分别为75 min(16α-BAP)和480 min(5α-DTB)。当在反应混合液中有底物孕酮或5α-二氮睾酮存在时,可降低抑制剂对酶活性的抑制速度。把标记的酶用盐酸水解,用氨基酸分析仪进行分析,最后确定,位于酶的活性中心的被标记氨基酸为组氨酸,它可能在氧化还原反应过程中发挥着重要作用。     

3-磷酸甘油醛脱氢酶胍变性时的活力及构象变化

酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶在盐酸胍溶液中的内源荧光及剩余活力的变化结果提示:apo酶及holo酶的活力在胍浓度为0.5M左右可完全丧失.同时伴有内源荧光强度的下降,光谱宽度的增加和335nm最大发射峰的红移(提示了色氨酸残基的暴露).与已经报导的肌肉酶(内源荧光强度在胍浓度为0.4—1.2M范围相对稳定)不同,酵母酶内源荧光在此浓度范围内表现为逐渐降低.在0.7M胍溶液中,内源荧光变化动力学过程只能测出一相,而酶失活动力学过程为快慢两相,快相动力学速度常数至少大于内源荧光降低速度常数三个数量级以上.以上结果提示:低浓度胍可引起该酶的完全失活,活性部位的空间构象比酶分子的构象更易受到变性剂的扰乱;有一个色氨酸残基位于或靠近酶的活性部位.     

基于转录组测序的细风轮花青素合成途径及关键酶基因分析

为进一步理解细风轮花青素合成途径,本研究利用华大基因BGISEQ-500平台对细风轮中的根、茎、叶、花4个组织进行了转录组测序,从头组装后得到128 856个Unigene。KEGG通路表明有40个Unigene编码了细风轮的花青素生物合成途径中6个关键酶。我们对其中的关键酶DFR（二氢黄酮醇还原酶）进行同源比对和空间结构模拟,结果显示DFR序列和结构均具有良好的保守性,且具有高度保守的NAD⁺结合位点,其二级结构主要由α螺旋和β折叠组成,在空间上α螺旋包裹着β折叠,形成“夹心饼干”样结构。     

植物精油对草菇双额岩小粪蝇的产卵驱避效果及毒力测定

在室内采用选择性试验测定了14种植物精油单组分化合物对草菇双额岩小粪蝇Bifronsina bifrons(Stenhammar)的产卵驱避效果及在室外采用非选择试验测定了其中3种化合物的产卵驱避效果及毒力测定。结果表明:各精油浓度为10 000 mg/L时,α-松油醇、丁香酚和茴香醛表现出明显的产卵驱避效果,其选择性产卵驱避率分别是60.17%±9.57%、51.07%±2.63%和47.66%±7.10%,产卵量均显著低于对照;月桂烯、α-蒎烯、β-蒎烯和异松油烯产卵驱避作用效果不明显。α-松油醇、丁香酚和茴香醛对双额岩小粪蝇幼虫均具有一定的毒性,对幼虫的校正死亡率分别是5.11%±3.54%、42.68%±3.94%和14.47%±6.92%;丁香酚对双额岩小粪蝇幼虫的毒力最大,LC_(50)为16 965.159 mg/L。其次是茴香醛,LC_(50)为311 941.332 mg/L。α-松油醇毒力最差,LC_(50)为40 676 080.550 mg/L。进一步非选择性试验结果表明α-松油醇(1 250 mg/L～20 000 mg/L)、丁香酚(625 mg/L～20 000 mg/L)和茴香醛(2 500 mg/L～20 000 mg/L)对双额岩小粪蝇具有明显的产卵驱避效果,驱避效果随施用浓度的增加而显著增加。在浓度为20 000 mg/L时α-松油醇、丁香酚和茴香醛的非选择性产卵驱避率分别为69.75%±3.98%、60.75%±1.94%和57.23%±3.38%。本研究为草菇生产中双额岩小粪蝇的无公害防治及高效环保的植物源驱避剂的开发提供参考。     

糜蛋白酶提高膜蛋白质谱分析序列覆盖率的胶内消化方法

近年来,质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中被广泛应用。由于膜蛋白的跨膜结构域含有大量疏水性氨基酸,常常导致液质串联质谱检测的序列覆盖率较低,从而限制了质谱技术在膜蛋白结构与功能研究中的应用。文中利用人的整合膜蛋白维生素K环氧化物还原酶为模型,优化胶内消化条件,建立了一种稳定提高膜蛋白质谱序列覆盖率的糜蛋白酶胶内消化方法。通过探索钙离子浓度、pH值和缓冲体系对序列覆盖率、检测特异肽段的总数和类型以及特异肽段大小的影响,发现在5–10 mmol/L钙离子浓度、pH 8.0–8.5的Tris-HCl缓冲液中,可以兼顾序列覆盖率和肽段的多样性。该方法可以使膜蛋白的质谱覆盖率达到80%以上,将在膜蛋白结构与功能、膜蛋白相互作用位点的鉴定以及膜蛋白与小分子药物结合位点的鉴定等研究中具有广泛的应用价值。