基于CRISPR/Cas系统的多重基因编辑与调控技术

规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关Cas蛋白所构建的CRISPR/Cas系统是古细菌或细菌中特有的一种获得性免疫系统。研究人员将其开发成基因编辑工具之后,凭借其高效、精准和通用性强等优点迅速成为合成生物学领域的热门研究方向,在生命科学、生物工程技术、食品科学及农作物育种等多个领域引发了革命性的影响。目前基于CRISPR/Cas系统单基因编辑与调控技术日益完善,但在多重基因编辑和调控方面仍存在挑战。本文聚焦基于CRISPR/Cas系统的多重基因编辑与调控技术开发及应用,针对单个细胞内实现多位点基因编辑或调控和细胞群体内实现多位点基因编辑或调控技术,依据作用原理对其进行了系统总结和阐述,包括基于CRISPR/Cas系统的双链断裂、单链断裂以及多重基因调控技术等。这些工作丰富了多重基因编辑与调控的工具,为CRISPR/Cas系统在多领域的应用作出了贡献。     

番木瓜果糖-2,6-二磷酸酶CpF2KP基因克隆和蛋白表达纯化

番木瓜是岭南四大名果之一,在我国东南部地区广泛种植,因其具有食用和药用双重价值,因此深受人们的青睐。果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase,F2KP)是一个独特的双功能酶,具有激酶功能域和酯酶功能域,能催化生物体内糖代谢的重要调节物果糖-2,6-二磷酸(Fru-2,6-P_(2))的合成和降解。为了研究番木瓜中编码该酶的基因CpF2KP的功能,得到目的蛋白尤为重要。本研究从番木瓜基因组中提取到CpF2KP基因的编码序列(coding sequence,CDS)序列,该基因CDS全长2274 bp。将该基因CDS全长扩增之后选用pGEX-4T-1载体进行原核表达。对载体pGEX-4T-1用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切,利用基因重组的方式将扩增序列构建到原核表达载体上。经过诱导条件探索,SDS-PAGE结果显示GST-CpF2KP重组蛋白的大小约为110 kDa,诱导CpF2KP蛋白表达的最适条件为:异丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)浓度为0.5 mmol/L,温度28℃。对诱导后的CpF2KP蛋白进行纯化,得到了纯化的单一目的蛋白。此外,检测了该基因的组织表达特性发现该基因在种子中表达量最高,在果肉中表达量最低。该研究为进一步深入揭示番木瓜CpF2KP蛋白的功能及研究该基因参与的生物学过程提供了重要基础。     

蛋白质结构和功能关系的教学实例——绿色荧光蛋白的发现和发展

蛋白质是生命的物质基础,几乎参与生命活动的每一个过程。蛋白质功能也存在多样性,如生物催化、代谢调节、免疫保护、转运储存等作用,这些功能的发挥都与蛋白的结构密切相关。因此,“蛋白质的结构与功能”是生物化学课程中的重要章节,涉及到生物学、化学、分子生物学等多学科的交叉,具有理论抽象和知识点繁杂等特点。本文以“绿色荧光蛋白的发现和发展”为例,探讨了蛋白质结构和功能关系教学的具体设计和实践,希望使“蛋白质的结构与功能”的课程教育更加简明易懂,并提高学生对课堂内容的重视度,旨在为生物化学教学改革提供参考。     

蛋白质生物物理研究的几个新动向——第十一届国际生物物理大会所见

三年一次的国际生物物理大会,第十一届会议于1993年7月在匈牙刊布达佩斯召开.这次大会共有五个大会报告.其中四个都是关于蛋白质研究的,说明蛋白质的生物物理研究仍然是生物物理领域内的主流.这五个大会报告是:     

冷藏温度对日本刀角瓢虫存活及生长发育的影响

【目的】本研究旨在调查不同冷藏温度下日本刀角瓢虫Serangium japanicum成虫生物学特性及F₁代的生长发育,明确日本刀角瓢虫成虫最适冷藏温度。【方法】将日本刀角瓢虫成虫置于不同低温(7,10,13和16℃),贮藏10 d时测定其存活率、单雌产卵量、寿命和对烟粉虱Bemisia tabaci 4龄若虫的日捕食量,以及日本刀角瓢虫F₁代存活率和发育历期;qRT-PCR测定日本刀角瓢虫成虫体内热激蛋白基因Hsp70和Hsp90的相对表达量。【结果】日本刀角瓢虫成虫在16℃低温贮藏10 d时,其存活率、雌雄成虫寿命、单雌产卵量和日捕食量以及F₁代存活率均与贮藏在26℃的对照无显著差异(存活率：99%vs 100%;雌成虫寿命：110.65 d vs 106.87 d;雄成虫寿命：123.12 d vs 108.79 d;单雌产卵量：399.19粒vs 422.63粒;日捕食量：34.70头vs 31.95头;F₁代存活率：80.39%vs 94.12%);但其F₁代发育历期...     

非洲猪瘟病毒I226R蛋白抑制cGAS-STING通路介导的天然免疫应答

本研究旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) I226R蛋白(I226R protein, pI226R)抑制cGAS-STING信号通路的作用机制。利用双荧光素酶报告系统和实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)证明pI226R显著抑制cGAS-STING通路介导的I型干扰素及干扰素刺激相关基因的产生。免疫共沉淀及激光共聚焦显微镜试验发现pI226R与cGAS蛋白相互作用。免疫印迹分析证明pI226R通过自噬-溶酶体途径促进cGAS蛋白的降解。同时,pI226R阻碍了cGAS与E3泛素连接酶三基序蛋白56 (tripartite motif protein 56, TRIM56)的结合,导致cGAS的单泛素化减弱,从而抑制了cGAS的活化和cGAS-STING通路的激活。总之,本研究证明ASFV pI226R通过拮抗cGAS进而抑制宿主的抗病毒天然免疫反应,进一步增加了对研究ASFV免疫逃逸机制的理解,为疫苗的研发提供了理论基础。