氟化钠促进节杆菌发酵合成环磷酸腺苷的生理机制

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)发酵过程中存在严重的"碳溢流"现象并伴随副产物腺苷的大量积累,导致cAMP产量和糖苷转化率低下.为提高cAMP产量和转化率,向发酵液中添加糖酵解抑制剂氟化钠,并从发酵动力学、酶活性分析、能量代谢及关键代谢物水平等方面,对发酵性能得以提高...     

去泛素化酶USP29调控CBX6蛋白质稳定性

多梳家族(polycomb group,PcG)是一类控制细胞命运和胚胎发育的转录抑制因子,主要以转录抑制复合物(polycomb repressive complex,PRC)的形式发挥功能.染色体盒蛋白质同源物6(chromobox protein homolog 6,CBX6)是PRC1的核心蛋白质亚基之一,在基...     

清栓酶对重度颅脑损伤恢复期患者的疗效观察及评价

清栓酶对重度颅脑损伤恢复期患者的疗效观察及评价蔡有根，吕仁发，张一城，秦秀香，胡小峰解放军第１８４医院（鹰潭市交通事故急救中心）清栓酶是从我国东北长白山白眉腹蛇中提取的一种治疗多种疾病的复合酶，具有去纤、降粘、解聚、溶栓，扩张血管改善微循环及促进神经...     

不同二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的比较研究

目的:在现有二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的基础上,探索更加高效的分离HSC方法。方法:分别采用链酶蛋白酶+胶原酶循环灌注、链酶蛋白酶非循环灌注+胶原酶循环灌注以及胶原酶单独循环灌注法分离大鼠HSC,比较三种方法的细胞获得率、活性和纯度差异。应用0.4%台盼蓝染色判断活性,结蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)细胞免疫荧光方法鉴定纯度。结果:链酶蛋白酶非循环灌注+胶原酶循环灌注法细胞获得率高于另两种方法,细胞活力高于链酶蛋白酶循环灌注+胶原酶循环灌注法,三组得到的细胞纯度均高于90%且无显著差异。结论:在三种二步酶灌注方法中,链酶蛋白酶非循环灌注+胶原酶循环灌注法能显著提高HSC获得率,且对细胞活力影响小,不降低细胞纯度,是一种高效的分离方法,有利于HSC相关肝脏疾病的生物学研究。     

阿加曲班对MCAO大鼠不同时间点血小板功能的影响

建立大脑中动脉闭塞(model of middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,研究阿加曲班对大鼠不同时间脑缺血再灌注损伤血小板功能的影响。将120只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)和阿加曲班给药组(Argatroban),其中Argatroban组分为4组:Argatroban+30 min组、Argatroban+1 h组、Argatroban+3 h组和Argatroban+7 h组,Sham组和Model组40只,其余各组每组10只。线栓法制备大鼠MCAO模型,术中输注Argatroban,剂量为0.3μg·kg^-1·min^-1,完成手术前5 min停止输注。手术完成后,Sham组和Model组分别于术后30 min、1 h、3 h和7 h处死10只取样;Argatroban给药组5个时间点处死取样。检测大鼠血浆血细胞数量,并计数骨髓有核细胞数的变化。采用流式细胞仪检测血小板-白细胞聚集体(platelet-leukocyte aggregates,PLA)表达水平,观察活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、血小板计数变化,ELISA检测血浆D-二聚体和TAT。结果显示,与Sham组相比,Model组大鼠的红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白含量(HGB)和中性粒细胞(GR)数都显著升高(p<0.05),且与给药组没有统计学差异。Sham组、Model组和Argatroban给药组的骨髓有核细胞数也没有统计学差异。与Sham组相比,Model组PLA表达水平极显著升高(p<0.01),Argatroban+30 min组PLA表达水平却低于Sham组,但没有统计学差异,Argatroban+1 h组高于Sham组和Argatroban+30 min组(p<0.05),Argatroban+3 h组和Argatroban+7 h组高于Argatroban+1 h组低于Sham组。术后各组的血小板计数均高于Sham组(p<0.05),Argatroban各组的血小板计数要低于Model组(p<0.05),并在30 min时达到最低,30 min以后血小板升高,但是1 h以后血小板不再升高,趋于稳定。Argatroban各组PT和APTT虽略有降低,但是与Sham组和Model组并没有统计学差异。造模后各组TAT、D-二聚体水平显著升高,Argatroban各组TAT水平较模型组明显降低(p<0.05),Argatroban+30 min组水平最低。MCAO模型大鼠血液呈现高凝状态,凝血功能和纤维蛋白溶解功能亢进,血小板活化增强,阿加曲班可对此起到改善作用。     

发菜磷酸葡糖胺变位酶(glmM)对干旱胁迫的响应及其基因克隆

glmM编码的磷酸葡糖胺变位酶是肽聚糖合成前体的关键酶。为探究发菜glmM响应干旱胁迫的表达调控机制及明确其分子信息,本研究对干旱胁迫条件下发菜glmM在转录水平的差异表达进行了分析,并对glmM的表达水平、磷酸化修饰、乙酰化修饰和琥珀酰化修饰水平进行了检测,克隆了发菜glmM,进行了序列分析和原核表达。结果表明,干旱胁迫条件下,发菜glmM在转录水平上的表达量先增加后减少,glmM上调表达,glmM的磷酸化修饰水平逐渐增加,乙酰化修饰水平相对稳定,琥珀酰化修饰水平有明显变化。设计特异性引物克隆glmM基因,获得全长1416 bp发菜glmM基因,与肺衣(5183)glmM的核苷酸序列同源性为95%,氨基酸同源性为97%。将glmM在大肠杆菌中表达,获得一个51.45 kD的外源蛋白,MALDI-TOF-TOF/MS分析证明该蛋白为磷酸葡糖胺变位酶。研究结果为深入研究发菜glmM的分子信息、生物学功能及其响应干旱胁迫的分子机制提供帮助。     

肝素C5异构酶的表达优化及分子改造

肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17) 是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体 (N-sulfoheparosan) 的D-葡萄糖醛酸 (D-GlcA) 上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸 (L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+) 和pCold Ⅲ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pCold Ⅲ表达酶活最高,达到(1 873.61±5.42) U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到 (2 409.25±6.43) U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体 (V153R) 的酶活和比酶活分别为 (5 804.32±5.63) U/L和(145.14±2.33) U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。