Aspergillus fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E突变研究

Aspergillus fumigatus来源的植酸酶具有热稳定性好、pH作用范围广的优点, 但其比活性很低。设计的植酸酶Q23L突变能在pH4.5～7.0范围内大幅提高比活性,但pH稳定性却显著下降, 为了进一步改良Q23L的pH稳定性, 在Q23L分子上加入了G272E突变。将原酶、突变酶Q23L和突变酶Q23LG272E分别在毕赤酵母GS115中表达,表达酶经纯化后进行酶学性质比较分析,结果表明：突变酶Q23L的比活性比原酶显著提高, 在pH5.5比活性由51u/mg提高到109u/mg, 但其pH稳定性, 尤其是在pH3.0～4.0酸性条件下的稳定性却显著降低,低于80%。突变酶Q23LG272E在pH3.0～4.5和pH6.5～7.0时的稳定性比Q23L有所提高, 恢复到原酶的水平,而比活性基本维持在Q23L的水平。通过一级序列和三维结构比较,分析了可能影响Q23LG272E酶学性质的因素,为进一步研究植酸酶的结构与功能提供了材料。     

表达神经营养因子Neurturin的骨髓间充质干细胞的构建及体外活性检测

研究神经营养因子Neurturin(NTN)在由于神经元损伤而造成的神经退行性疾病中对神经元的保护和修复作用。利用重组腺病毒载体将NTN基因转入恒河猴骨髓间充质干细胞(rMSC),通过RT-PCR、IF及Western blot方法检测NTN的转录和表达,并采用鸡胚背根神经节体外培养实验和胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元存活实验对NTN进行体外活性检测。结果表明NTN在rMSC中稳定表达和分泌,并具有体外生物学活性,为由于神经元损伤造成的神经退行性疾病的干细胞移植治疗奠定了一定的基础。     

实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较

常规PCR及RT-PCR已用于对虾DNA及RNA病毒检测,但存在费时、灵敏度较低、不能定量等问题。建立了TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR方法,分别用于检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)4种对虾病毒。与常规PCR及RT-PCR比较,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR检测上述4种对虾病毒不仅有很高的特异性,检测灵敏度也提高了10～100倍,同时还具有快速、简便、不污染环境、重复性好、实时定量等优点,可明显提高对虾病毒检验检疫工作质量及效率。     

基于CdSe阳离子交换的玉米赤霉烯酮新型荧光免疫检测方法的建立及应用

作为镰刀属真菌的次级代谢产物,玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)具有强烈的生殖毒性和免疫毒性,严重威胁动物和人类健康。本研究通过采用羧基修饰的CdSe水溶性量子点(quantum dots,QDs)标记ZEN单克隆抗体,并基于CdSe阳离子交换信号增强原理,建立了ZEN新型荧光免疫检测方法(CdSe QDs-FLISA),检测下限(IC₁₀)和半数抑制率(IC₅₀)分别为0.006 ng/mL和0.17 ng/mL,检测区间(IC20–IC80)为0.01–0.45 ng/mL。与ZEN的结构类似物(α-zearalanol、zearalanone、α-zearalenol、β-zearalenol and β-zearalanol)交叉反应性依次为22.3%、13.1%、6.2%、1.6%和3.9%,与农产品中其他真菌毒素如黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、赭曲霉毒素A(OTA)、呕吐毒素(DON)和伏马毒素B₁(FB₁)几乎不存在交叉反应。该方法...     

高效液相色谱测定发酵液中1，3－二羟基丙酮（DHA）方法的建立

摘要：本文建立了简单且准确的测定1,3-二羟基丙酮（DHA）的高效液相色谱（HPLC）方法。以Alltima C18（5μm,250×4.6mm）为分离柱,5％甲醇水溶液（0.05％H3PO4调pH至3.0）,流速为1mL/min,用紫外检测器在200nm处检测DHA。结果测得DHA标准样品的保留时间为6.2min,并测得DHA的线性范围为0.1～10.0 g/L。用HPLC法测得以甘油为底物发酵产DHA发酵液中DHA含量为6.2 g/L。并证明高效液相色谱法可有效应用于产DHA发酵过程中产物的检测。     

一步法发酵菊芋生产乙醇

利用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)YX01具有菊粉酶生产能力且乙醇发酵性能良好的特点,直接发酵菊粉生成乙醇.在摇瓶中考察了该菌株最适发酵温度,进而在2.5L发酵罐中考察了通气量和底物浓度的影响.实验结果表明:该菌株最适发酵温度为35℃;在通气量为50 mL/min和100 mL/min时菌体生长加快,发酵时间缩短,但在不通气条件下糖醇转化率明显提高;在菊粉浓度235 g/L时,发酵终点乙醇浓度达到92.2 g/L,乙醇对糖的得率为0.436,为理论值的85.5%.在此基础上,使用近海滩涂种植海水灌溉收获的菊芋为底物,以批式补料方式直接发酵菊芋干粉浓度为280 g/L的底物,发酵终点乙醇浓度为84.0 g/L,乙醇对糖的得率为0.405,为理论值的80.0%.这些研究工作,为以菊芋为原料的燃料乙醇技术开发奠定了基础.     

基于免疫纳米颗粒强化的压电免疫传感器检测大肠杆菌O157︰H7

摘要：【目的】结合纳米技术建立检测大肠杆菌（Escherichia coli）O157︰H7高灵敏检测技术。【方法】采用化学共沉淀法制备出核心粒径约为10 nm的免疫纳米磁颗粒,柠檬酸钠还原法制备粒径约为20 nm的免疫胶体金。压电免疫传感器通过金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A from Staphylococcus aureus SPA）法将抗体固定于石英晶振上,两种免疫纳米颗粒借助不同的抗体连接于传感器上对检测频率信号进行放大。【结果】SPA在石英晶振上的最佳固定浓度和时间为1.2 mg/mL和40 min,抗体的最佳固定浓度和时间为1.0 mg/mL和60 min。压电免疫传感器通过两种免疫纳米颗粒的放大作用,使其对大肠杆菌O157︰H7的检测限从104 cfu/mL提高到101 cfu/mL。【结论】免疫纳米颗粒强化对压电免疫传感器的检测频率信号具有很好的放大效应,可以明显提高其检测灵敏度。     

长效促胰岛素降糖酵母的构建及其对糖尿病模型小鼠的治疗效果

益生菌生物药物是指通过口服表达药用多肽(蛋白)的重组益生菌活细胞达到治疗疾病的新型口服给药系统。为了构建一种能有效防治2型糖尿病的酵母生物药物,文章首先构建了酿酒酵母(S.cerevisiae)整合型表达载体pNK1-PGK,并且通过绿色荧光蛋白(GFP)证明其表达功能正常,利用该载体将10×GLP-1 (Glucagon-like peptide-1)基因转化到酿酒酵母INVSc1中,通过营养缺陷型和Western blotting成功筛选出表达10×GLP-1的长效促胰岛素降糖酵母(Long-acting GLP-1 hypoglycemic yeast, LHY)。该酵母生长迅速,外源基因10×GLP-1表达稳定,表达量达到1.56 mg/g细胞湿重。通过链脲佐菌素和高脂高糖饮食联合诱导的方法构建了2型糖尿病小鼠模型,用LHY对其进行口服灌胃治疗,证明LHY具有较好疗效,明显降低血糖水平。     

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18-T载体中。以此片段构建了pPIC9K-phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G418抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS-PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 39583u mL发酵液 (PP N1422 )和14 89083u/mL发酵液 (PP-N1444)的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (422u/mL)的 34113倍和 35286倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2.5～3.0和 5.0～5.5时酶活性最高 ,且在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为55℃。     

浅谈食品检测实验室的有效管理

在多年的检测工作中,我们意识到食品检测实验室的有效管理与行业本身的要求有密切关系,它关系到机构本身的生存,以及在未来的发展和过渡期的传承。为在实际工作中来促进食品检测室的有效管理,我们来认识食品检测实验室管理的多样性和差异性。