常规诱变结合高通量筛选选育可利霉素高产菌株

可利霉素是通过基因工程定向育种技术获得的新型大环内酯类抗生素,是国家一类新药.[目的]为满足工业化生产需要,其工程菌株的发酵水平有待提高.[方法]多种常规诱变技术交替处理和高通量筛选方法选育可利霉素高产菌株,处理方法包括原生质体紫外诱变、DES(硫酸二乙酯)诱变、紫外光复活诱变、缬氨酸抗性筛选和正突变菌株的富集.[结果]高产菌株WSJ-1-7-49-133-82-43的摇瓶生物效价比出发菌株WSJ-1-7-49提高56％,500L中试发酵罐突变菌株效价较出发株高61％.[结论]说明多轮常规诱变育种结合高通量的筛选方法可以用于工业生产菌株的高效筛选.     

采用磁微粒分离酶联免疫法构建基于KGN细胞的雌激素生物合成筛选模型

雌激素在机体生长发育中发挥着重要作用,其合成代谢紊乱会导致乳腺癌和骨质疏松等疾病发生.目前,基于细胞的雌激素合成筛选模型需用到放射性底物,对环境污染大,成本较高,限制了具有组织特异性调控雌激素合成的药物筛选.我们以高表达芳香化酶的KGN细胞为检测对象,比较基于聚苯乙烯酶联免疫法和磁微粒分离酶联免疫法的雌二醇ELISA试剂盒的交叉反应和灵敏度,发现相对于聚苯乙烯酶联免疫法,磁微粒分离酶联免疫法能够稳定高效的检测雌激素合成.进一步比较培养基中酚红和底物睾酮对雌二醇检测的影响,成功建立通过磁微粒酶联免疫法检测KGN细胞雌二醇合成的筛选模型.     

靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)粘肽合成酶PBP3的抗菌先导化合物的虚拟筛选及活性研究

【目的】开发出与铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3有高亲和力,具有全新结构的先导化合物。【方法】以铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3为靶点,通过分子对接软件DOCK6.5,对含有104万个小分子化合物的数据库进行了大规模虚拟筛选,选取结构相对简单的中选化合物进行合成,得到先导化合物,并验证其抑菌活性。【结果】通过grid score进行第一轮初筛,筛选出grid score分值小于–30 kcal/mol的6万个化合物,接着以amber score进行第二轮筛选,筛出amber score分值小于–20 kcal/mol的化合物约200个。最终,经过观察分析,从中挑选出4种打分高并且结构新颖的小分子化合物作为先导化合物。合成出的先导化合物及其衍生物对铜绿假单胞菌等常见微生物的最小抑菌浓度(MIC)在175–275μg/m L之间,对革兰氏阴性菌和阳性菌均有效,MIC值比作为阳性对照的磺胺嘧啶更低,说明先导化合物具有较好的抗菌活性。【结论】这些先导化合物可以进一步开发为新型抗菌药物,用于解决铜绿假单胞菌的耐药性问题。     

高产莫纳可林K低产桔霉素红曲霉菌株的筛选和发酵条件初步优化

采集全国各地红曲霉制品中的红曲霉资源,经分离获278株红曲霉菌株。高效液相色谱(HPLC)法测定各菌株发酵液中莫纳可林K(Monacolin K)和桔霉素含量,筛选获1株Monacolin K产量较高、桔霉素含量较低的红曲霉菌株编号为M-22。依据形态特征和ITS基因序列,参照红曲霉属分类检索表,鉴定M-22菌株为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。通过摇瓶发酵对温度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素进行优化,确定M-22菌株摇瓶发酵产Monacolin K适宜条件为发酵温度26℃、初始pH 5.0、转速160 r/min,甘油为碳源、蛋白胨为氮源、碳氮比(C/N)为5:1,Monacolin K产量显著提高,最高为107.16 mg/L。以优化的发酵条件对M-22菌株进行5 L发酵罐发酵,发酵液中Monacolin K产量最高为189.83 mg/L,桔霉素含量32.53μg/L,红曲色素色价为16.38 U/m L。     

不同抗生素对金发草愈伤组织生长分化的影响

该研究以金发草愈伤组织为材料,通过分析比较不同抗生素种类(卡那霉素、潮霉素、头孢噻呋钠和氨苄青霉素)和浓度对金发草愈伤组织生长分化的影响,来确定适用于金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂和抑菌剂。结果表明：(1)金发草愈伤组织对卡那霉素很敏感,且其分化率随着卡那霉素浓度的增加显著减少( P＝0.01)。当卡那霉素浓度为10 mg·L-1时,金发草愈伤组织的生长分化受到明显抑制,且有大量的白化苗形成,但分化率仍有36.56％;当卡那霉素浓度为15 mg·L-1时,金发草愈伤组织的分化率为11.94％,只有很少部分的愈伤分化出绿色的丛生苗;当卡那霉素浓度为20 mg·L-1时,金发草愈伤组织基本褐化死亡,分化率仅为2.26％。因此,浓度为15 mg·L-1的卡那霉素适合作为金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂。(2)金发草愈伤组织对潮霉素的敏感性要比卡那霉素弱,且潮霉素对金发草愈伤组织分化率的影响小,但毒害作用大。因此,潮霉素不适合作为金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂。(3)300 mg·L-1的头孢霉素和氨苄青霉素对金发草愈伤组织生长分化影响很小且能有效抑制杂菌的生长,较高浓度的氨苄青霉素对金发草愈伤组织的抑制作用不太明显。因此,300 mg·L-1的头孢霉素和较高浓度的氨苄青霉素均可作为金发草遗传转化体系中的抑菌剂。该研究确定了适用于农杆菌介导的金发草遗传转化体系中的抗性筛选剂和抑菌剂,为金发草的遗传改良及功能性基因的研究奠定了基础。     

白芨SSR引物筛选及群体遗传多样性研究

白芨(Bletilla striata Rchb.)为中国珍稀濒危植物,重要的药用植物。该研究基于Illumina测序技术构建白芨基因组文库和微卫星文库,设计白芨微卫星引物,用白芨4个野生种群80个个体对引物进行多态性检测,应用4个白芨近缘种中进行引物的通用性检测,并在此基础上分析了白芨的遗传多样性和遗传分化,以探讨白芨的遗传结构和进化潜能。结果表明:(1)白芨基因组中微卫星片断丰富,共检测出17 841条微卫星片断。基于白芨微卫星库对100个位点设计了引物对,经PCR扩增和检测筛选出能够稳定扩增的多态性位点20个,每个位点的复等位基因数(Na)在2~6之间,平均为3.85;20对引物的大部分能够在4个白芨近缘种中成功扩增。(2)白芨在物种水平均有较高的遗传多样性(Na=3.85,I=1.07,H=0.614 7),白芨种群遗传分化强烈(Gst=0.43),居群间的基因流较弱(Nm=0.867 6),居群聚类分析结果均表明地理距离较近的居群具有较近的遗传关系。     

3％大蒜精油水乳剂的研制

本研究旨在研发出一种以大蒜精油作为主要活性成分的水乳剂剂型,能够降低大蒜精油在自然条件下的挥发速度,使其具有长效的杀虫活性。通过采用不同高分子乳化剂、阴离子表面活性剂及辅剂的复配筛选,通过对乳液的流动性、分散性、储藏稳定性等指标的对比分析,确定了3%大蒜精油水乳剂的最佳配方为:大蒜精油3%,蓖麻油聚氧乙烯醚EL-40为2%,乳化剂A为3%,十六醇含量1%,甲基纤维素钠盐0.2%,纯水补足100%。该大蒜精油水乳剂各组分均对人体及环境安全,其外观、乳化稳定性、热贮稳定性、冷贮稳定性等各项指标均符合水乳剂的各项标准。     

离体诱变定向培育高油花生新品种宇花9号

笔者前期研究发现经干旱胁迫处理后的花生叶片水势与其籽仁含油率呈显著正相关。文中对羟脯氨酸作为水势(渗透压)调节物质用于离体定向筛选花生高油突变体及培育花生新品种进行了研究。以花生品种花育20号胚小叶作为外植体,平阳霉素作为诱变剂添加于体胚诱导培养基上进行离体诱变培养。形成的体胚转移到添加6 mmol/L羟脯氨酸(培养基水势为-2.079 MPa)的体胚萌发和再生培养基上诱导体胚萌发成苗,同时进行高油突变体定向筛选。再生小苗经嫁接移栽田间,从再生植株后代中获得了132份含油率55%以上的高油突变体,其中27份含油率超过58%,2份超过60%。再生植株后代结合系谱育种法育成了高产高油花生新品种宇花9号,在辽宁省花生新品种备案试验中,籽仁产量比对照品种增产14.0%,并通过了国家非主要农作物品种登记。宇花9号含油率达61.05%,比亲本花育20号高11.55个百分点,是目前国际上含油率最高的花生品种。本研究结果表明,利用离体诱变、培养基低水势定向筛选及其再生植株后代结合常规育种法选择是定向培育高油花生品种的有效方法。     

地黄SCoT分子标记体系的建立和指纹图谱的构建

该研究采用L_(25)(5~6)正交设计和单因素两种方法,对影响地黄SCoT-PCR反应的5个因素(模板DNA浓度,引物浓度,ddH_2O和Mix的用量以及退火温度)进行了优化。结果表明:优化后的反应体系总体积为25μL,含有8μL ddH_2O,1μL模板DNA(80 ng·μL~(-1)),1μL引物(8μmol·L~(-1))和15μL Mix,退火温度为45℃。运用30份地黄种质材料,对优化的SCoT-PCR正交体系进行多次重复验证,获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,证明该反应体系稳定可靠。利用该体系对32条SCoT引物进行两次筛选,得到14个扩增产物清晰、重复性好且多态性条带相对较高的引物。利用SCoT_4等5条引物构建了上述地黄2个种共30份种质的SCoT指纹图谱。利用这5个SCoT引物指纹图谱可将7个地黄常用栽培品种区分开。这表明SCoT分子标记体系适用于地黄主要品种亲缘关系及遗传多样性的研究,所构建的指纹图谱也为地黄常见的7个栽培品种的区分提供参考依据。     

七姊妹山常绿落叶阔叶混交林物种多样性格局及其环境解释

依托七姊妹山自然保护区6 hm²森林动态监测样地研究平台,基于样地和物种基本信息数据,采用多元回归树和冗余分析研究方法,探讨地形因子对生境的塑造作用及物种分布特征,分析不同群丛类型下物种多样性的变化规律。结果表明：(1)依据“1 SE”规则,4次分割依次以海拔(1 453 m)、坡度(23.13°)、海拔(1 398 m)、凹凸度(4.094)为分界点可将150个样地分为5个群丛。(2)冗余分析表明地形因子对物种分布解释量为0.077 6,解释率为16.36%,各环境因子对物种分布的解释力度依次为：海拔>坡度>凹凸度;坡向与物种的分布无显著相关性。(3)5个群丛中立木密度与胸高截面积最高的均为群丛5(527.4株/400 m²;3.495 cm²/株),立木密度与平均胸高截面积最低为群丛4(225.4株/400 m²;3.057 cm²/株)。(4)5个群丛中Shannon Winener丰富度指数与Simpson优势度指数最高的均为群丛2,最低的为群丛5,物种多样性尺度效应明显;Pielou均匀度指数最高为群丛4,最低为群丛5。(5)两两群丛间Jaccard相似性系数最低为群丛1 群丛2(0.331),最高的为群丛4 群丛5(0.645),海拔对β多样性格局影响较大。研究认为,七姊妹山自然保护区6 hm²样地地形因子对该区域生境的塑造具有一定作用,海拔、坡度、凹凸度组成的“环境筛”影响了该区域的物种分布及多样性格局。