谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选

【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。     

应用动态光散射对一些蛋白质结晶性能的研究

动态光散射是研究生物大分子溶液物化行为和结晶性能的重要工具。以溶菌酶为模型蛋白 ,对其溶液的DLS研究表明 ,一定范围的蛋白质浓度不会影响蛋白质聚合性质 ,而起沉淀剂作用的盐对多色散性的影响较大。考虑这些研究结果 ,应用DLS研究对空间微重力下晶体生长样品的质量做了考察 ,这对于提高空间样品准备水平 ,进而提高空间实验成功率是一重要途径。     

木材成分的生物分解与生物工程

近年来,生物技术的发展极为迅速,其应用范围正在不断扩大,在林产资源化学成分的加工利用中,纤维素、半纤维素和木质素等木材主要成分的转化的各种过程,都有可能使用微生物或酶。而用以改良微生物性能的重组DNA、细胞融合等遗传工程手段,在这些方面将发挥越来越大的作用。本文主要介绍最近有关微生物或酶分解木质素的报道,和该研究领域中生物工程应用的现状以及今后有待开发的课题。     

基因治疗中关于非病毒载体的最新设计策略

基因转移的非病毒技术近来发展迅速,与病毒转染细胞的方法相比,非病毒转移方法比较简便,安全,毒性小。这种方法大体可分为两种：完全非病毒方法和病毒增强的转移方式。本文主要介绍一些最近两三年来新兴的技术方案的优点和不足。     

血栓调节蛋白化学发光免疫分析检测方法的建立*

目的:建立并评价基于板式化学发光免疫分析(CLIA)平台的血栓调节蛋白(TM)定量检测方法。方法:以链霉亲和素包被微孔板,加入待检血浆,偶联生物素和辣根过氧化物酶的配对抗体组成分析体系,采用双抗体夹心模式,建立TM抗原定量检测方法,并对其进行条件优化和性能评价。结果:生物素化抗体和酶标抗体的工作浓度分别为0.5 μg/mL和0.75 μg/mL,加样后的孵育时间选为15 min,最低检测限为0.2 TU/mL,该检测方法的检测范围为1~200 TU/mL,批间和批内精密度(CV)均小于8%,37 ℃ 10天稳定性良好,207份临床血浆测值与希森美康测值相关性较高(R²>0.96)。结论:建立了TM板式化学发光定量检测方法,且各项性能指标良好,可满足临床检测的需要。     

基因治疗研究的国内外进展

引言基因治疗,(GeneTherapy),是指在基因水平对人类遗传疾病进行治疗。具体地说,基因治疗是利用基因转移或基因调控的手段,将正常基因转入疾病患者机体细胞中,取代突变基因,表达所缺乏的基因产物,或者通过关闭或降低 异常表达的基因等途径,达到治疗某些人类疾病的方法。目前的科学发展水平还只能在体细胞水平上对单基因遗传病进行基因治疗,随着科学的发展将会有越来越多的疾病能用此法进行根治。     

固体脂质纳米粒的制备及在治疗中的应用研究

固体脂质纳米粒(SLN)是20世纪90年代发展起来的一种性能优异的新型纳米粒给药剂型作为一种新型载体,可有效提高包封药物的稳定性、提高病变部位靶向性、低毒性与组织亲和性,为药物的体内递送提供了一种新的方法。本文主要针对固体脂质纳米粒的制备,发展现状,目前存在的问题及解决思路等作以介绍与总结。并在此基础上,介绍了新的脂质纳米粒,纳米脂质载体(nanostructured lipid carriers,NLC)和药脂结合物纳米粒(Lipid drug conjugate nanoparticles,LDC),以及未来固体脂质纳米粒的发展方向。     

团头鲂GPR43基因克隆、组织分布及黄连素对其mRNA表达量的影响

试验采用RACE技术克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)G蛋白偶联受体43(GPR43)基因的cDNA序列, 并探究了不同组织中的GPR43 mRNA表达量及黄连素对其表达量的影响。结果显示, 克隆得到的团头鲂GPR43基因的cDNA序列全长为2026 bp, 含有1个长度为 981 bp的开放阅读框, 编码了326个氨基酸。RT-PCR检测发现GPR43在团头鲂的肠道、肌肉、鳃和肝胰腺中具有较高的表达。为期8周的养殖试验选取均重为(80.00±0.90) g的团头鲂320尾, 随机分于16个网箱中, 饲喂4种不同的试验日粮, 分别为正常日粮(脂肪含量为5%)、正常日粮+50 mg/kg黄连素、高脂日粮(脂肪含量为10%)、高脂日粮+50 mg/kg黄连素。结果显示: 在肠道组织中, 与正常日粮组相比, 高脂组的GPR43表达量降低, 添加黄连素能够显著升高其表达水平(P<0.05)。与正常日粮组相比, 高脂组的胆固醇(CHO)含量以及细胞分裂素蛋白激酶(p38)的表达量均呈现了显著上升(P<0.05)的趋势, 添加黄连素后其含量及表达量显著下降(P<0.05)。肝胰腺组织和肌肉组织中的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量变化也有着相似的趋势, 而肉碱棕榈酰基转移酶Ⅰ(CPT Ⅰ)、过氧化物酶体增值因子α&β (PPARα&β)、AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)的表达量以及2个组织中的饱和脂肪酸(SFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)含量呈现出了相反的趋势。此外, 在正常日粮中添加黄连素并不能对上述各指标产生明显的调控效应, 有时反而会导致轻微的负调控效应。综上结果表明, 黄连素能够显著上调GPR43在高脂抑制下的表达量, 同时能够缓解高脂诱导的团头鲂肝胰腺脂肪沉积, 改善其脂肪代谢性能。黄连素对于脂肪代谢的调控作用可能通过GPR43受体来实现。     

本生烟eIF4Es基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus, CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus, UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病,是危害木薯的主要病害之一。目前尚无有效防治方法,并且特别是缺乏CBSV/UCBSV抗性育种材料。真核翻译起始因子4E (eukaryotie translation initiation factor4E, eIF4E)不仅参与蛋白质的翻译起始,并且Potyviruses的复制和翻译也依赖于eIF4E与病毒基因组连接蛋白(virus genome linked protein, VPg)的相互作用,目前发现的植物隐性抗病基因大部分都是eIF4E家族的等位基因。本研究利用生物信息学方法和RT-PCR技术获得本生烟(Nicotiana benthamiana) eIF4E家族的8个基因,聚类分析显示它们分别编码eIF4E、eIF4E的异构体和类似帽结合的蛋白。为筛选与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E家族蛋白,本研究进一步构建了这8个基因的Lex A-酵母双杂交系统的诱饵载体,并导入酵母细胞EGY48 (p8op-LacZ)进行细胞毒性和自激活检测。结果显示导入重组质粒的EGY48 (p8op-LacZ)酵母细胞在SD/-His/-Ura缺陷型培养基上生长良好,在SD/-Trp/-Ura缺陷型平板上不生长,并且在SD/Gal/Raf/-His/-Ura/X-Gal培养基上不显蓝色,说明重组质粒表达产物不仅对该酵母细胞无毒性,而且对下游报告基因无自激活作用,可用于该系统的互作蛋白筛选研究。本研究为利用酵母双杂交系统发现与CBSV/UCBSV相互作用的本生烟eIF4E基因,探索通过基因编辑与CBSV/UCBSV互作的寄主因子进行抗CBSV/UCBSV分子育种提供科学依据。