Journal of Hepatology:发现丙肝病毒感染关键模式识别受体

<正>中科院上海巴斯德研究所钟劲研究组通过表达突变型的MAVS蛋白,构建了丙型肝炎(HCV)病毒感染可诱导固有免疫反应的新型细胞系,发现RIG-I并不是HCV病毒感染过程中的关键模式识别受体。相关研究成果已在线发表于《肝脏病学杂志》。HCV是人类的重要病原体,能够通过逃逸宿主的免疫防御系统来建立持续性感染,导致肝硬化和肝癌。病毒在感染过程中被宿主细胞的模式识别受体识别,从而激活固有免疫系统产生抗病毒反应。研究表明RIG-I样受体解旋酶家族中的宿主蛋白RIG-I在肝细胞中转染HCV基因组的3'UTR RNA可以被RIG-I识别并激活干扰素的表达,是HCV的模式识别受体,但该现象从未在HCV病毒感染过程中得到证明。     

基因治疗20年

1990年9月14日美国NIH临床中心首次采用基因治疗成功治愈腺苷脱氨酶（ADA）基因缺陷而患重度联合免疫缺损和免疫系统功能低下疾患,至今已整整20年,其发展迅速,从单纯的重组技术导入基因DNA发展到了涵盖DNA和RNA两个干预水平、和基因上调（如基因增补、矫正、置换等）及下调（基因失活）的两大策略,近年来的进展使得基因治疗登入《Science》杂志2009年度十大科学进展,我国在基因治疗领域诞生了第一个上市药物,有10多个制剂临床前和多个在临床研究。基因治疗在遗传病治疗中具备巨大潜力,已经成为当代生命科学中最有前景的研究方向之一。     

评估国产（1,3）-β-D-葡聚糖检测试剂的诊断价值

目的比较国产与进口（1,3）-β-D-葡聚糖（BG）检测试验并对国产试剂在侵袭性真菌感染中的诊断价值进行评估。方法回顾性调查2008年4月～2009年5月我院203例（342份样本）怀疑侵袭性真菌感染的住院患者,根据诊断标准分为感染组和非感染组,对其中同时进行国产与日本试剂检测的100份样本进行配对t检验比较;在不同的判断标准下计算国产试剂的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等,采用McNemar配对χ2检验对不同方法进行比较。结果国产和日本试剂在感染组和非感染组配对t检验结果分别为P=0.235,P=0.076;国产试剂以单次≥20pg/mL和≥50pg/mL为界值的灵敏度、特异度分别为78.3%,67.2%和56.5%,85.0%,双次≥20pg/mL和≥50pg/mL为界值的灵敏度、特异度分别为25.0%,64.9%和25.0%,87.7%。结论国产与日本试剂检测值无统计学差异;国产试剂单次≥50pg/mL为界值较20pg/mL可以明显提高特异度,降低假阳性率,而不影响灵敏度。连续双份血清阴性（BG〈50pg/mL）具有较高的特异度和阴性预测值。     

“维生素C的检测”实验中鉴定试剂的替代

<正>在义务教育课程标准实验教科书七年级下册生物学(北京师范大学出版社)第4单元第8章人体的营养第1节人类的食物中,有一演示实验——维生素C的检测,该实验是这样做的:取     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.     

PEI在动物皮肤组织基因转化中的应用研究

用低分子量的聚乙亚胺(PEI)开发一种新的非病毒基因转染系统,为基因在皮肤组织中的有效转染提供一种可靠、廉价的方法。将带有绿色荧光蛋白报告基因(gfp)的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺结合,用肝癌细胞株CM7721试验,研究其转染效率及可能引起的细胞毒性;进一步转染小鼠皮肤组织,研究转染基因的表达位置及持续表达时间。结果发现,低分子量PEI介导的细胞转染效率最高可达55%,转染效率与PEI结构无关(P>0·05),但是随着PEI分子量的增加,其转染活性略有下降。同时,随着分子量的增加,PEI对细胞的毒性也相应加大;小鼠皮肤转染实验显示,转染24h后,gfp即可在皮肤组织的毛囊、汗腺、皮脂腺等处高效表达,表达可持续7~9d;进一步对皮肤用氮酮、维甲酸处理后,gfp可在皮肤组织的颗粒层细胞中高效表达。PEI是一种高效、有用的非病毒基因转染载体,能够在体外培养的动物细胞及动物皮肤组织中进行基因转移,这对皮肤疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。     

用于哺乳动物细胞转染的高纯度质粒DNA的制备

目的：建立简便高效、成本低廉和安全无污染的高纯度质粒提取方法。方法：在乙酸铵方法的基础上加以改进,主要改进之处在于增加了用聚乙二醇纯化质粒的步骤,并对溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的成分和具体实验参数也做了合理的改进,以最少的步骤,充分去除了残存杂质,保证了质粒的超纯状态。结果：用本方法提取的质粒与用QIAGEN plasmid midi Kit提取的质粒在理化指标上没有差别,对哺乳动物胞具有同样的转染效率。结论：本方法可完全取代QIAGEN公司的试剂盒用于提取超纯质粒。     

基因枪技术及其在基因治疗中的应用进展

目前基因转染载体主要分为病毒型载体和非病毒型载体,病毒载体虽转染率较高、表达时间长,但其安全性令人担忧,非病毒载体中基因枪的优势最为明显,临床化趋势最强。通过分析非病毒基因转染技术面临的障碍,介绍了基因枪技术的产生和原理及其显著的优势,并总结了当前基因枪技术在基因治疗中的应用,指出了基因枪技术发展面临的问题和发展方向。     

半乳糖配体介导大鼠白介素10基因在大鼠肝脏内的靶向表达

目的 探讨大鼠白介素10（rIL-10）基因是否可通过半乳糖配体介导的脂质体转染法在大鼠肝脏内靶向表达。方法将已构建好的rIL-10基因真核表达质粒与半乳糖配体转染试剂按jetPEI．Gal／DNA（N／P=10）比例混合,通过尾静脉注射转移至大鼠体内。RT—PCR法和ELISA法检测rIL-10基因转移至体内0h、24h、7d和16d后大鼠肝、肾、脾和肺组织及血清中rIL-10的表达情况。结果rIL-10基因转移前大鼠肝、肾、脾和肺组织末扩增出明显rIL-10mRNA表达,转移7d后rIL-10表达主要分布在肝组织。肝组织中rIL-10mRNA表达在基因转移24h和7d时显著升高。血清中的rIL-10浓度在转移后24h和7d浓度分别为（107．92±12．26）pg／ml和（33．2±13．15）pg／ml。结论rIL-10基因通过半乳糖配体介导的脂质体转染法可有效的转移至大鼠体内,并可在肝脏靶向表达一周左右时间。     

过表达外源ST3Gal I增加MCF-7细胞与胞外基质粘附和侵袭能力

为探讨过表达外源α2,3-唾液酸转移酶（ST3Gal Ⅰ）对乳腺癌MCF-7细胞粘 附和侵袭能力的影响,构建pEGFP-N1-ST3Gal I真核表达载体.采用GenEscortTM Ⅱ包裹后转染MCF-7细胞. MCF-7细胞为3组：未转染组 (M)、转染空质粒组 (P) 和转染ST3Gal I组 (ST3); 荧光显微镜观察融合蛋白EGFP ST3Gal I的表达.采用 半定量RT-PCR、Western印迹法分析转染后MCF-7细胞ST3Gal Ⅰ基因mRNA水平和 蛋白表达水平;流式细胞术分析ST3Gal Ⅰ下游产物细胞表面α2,3-唾液酸含量;采用细胞粘附实验及transwell小室检测转染前后细胞与基质胶Matrigel粘附、迁移和侵袭运动能力的变化.结果表明, 荧光显微镜下P组细胞内绿色荧光呈弥散分 布,而ST3组绿色荧光主要集中在细胞质中,RT-PCR与Western印迹也证实了外源 ST3Gal Ⅰ基因mRNA和蛋白表达均明显增加（P<0.05）,其下游产物细胞表面 α2,3-唾液酸含量明显增加（P<0.05）;与M、P组相比,ST3组表现为粘附、迁移和侵袭能力明显增强（P<0.05）.利用转染技术可明显提高外源ST3Gal Ⅰ在MCF -7细胞表达,明显增加MCF-7细胞与胞外基质（ECM）粘附、迁移和侵袭能力,可形成肿瘤入侵表型,将有望成为治疗乳腺癌转移的新靶点.