姜老师信箱

蛋白质研讨班学员问:姜老师,您好!我是刚结束的"第13期蛋白质分离纯化技术专题研讨班"学员,您的授课让我获益良多。学习期间我曾向您请教过用NHS柱偶联抗原来纯化多克隆抗体的问题。关于偶联抗原蛋白量的计算,NHS柱商品说明书上显示配体密度为16-23μmol/ml干介质(ligand density:16-23μmol/ml drained medium),我使用的抗原分子量约为     

Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用

建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组YB-1蛋白免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经ELISA法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备anti-YB-1 mAb;Protein G亲和层析法纯化mAb,ELISA法测定mAb效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定anti-YB-1 mAb识别表位所在区域。Western blot和免疫组化鉴定mAb识别内源性YB-1的特异性。经筛选鉴定获得2株稳定分泌anti-YB-1 mAb的杂交瘤细胞(1-D9,3-E8);腹水抗体效价均≥1×10-6,亚型均为IgGl;1-D9和3-E8单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实anti-YB-1 mAb能特异性识别内源性YB-1。该研究为YB-1免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨YB-1的生物学功能奠定了基础。     

香石竹种质离体保存研究进展

香石竹是世界四大切花之一,具有重要的观赏价值。其种质资源主要依靠田间种质圃和离体库进行保存。离体保存包括试管苗保存和超低温保存,这两种方法作为田间种质圃保存的补充可以分别对种质资源进行短中期和长期保存。本文对香石竹离体保存的相关研究进行了概括总结,旨在为香石竹种质资源的保存提供参考。     

超声波均质化对仙台病毒ELISA测试中抗原稳定性的影响

目的研究超声波均质化（homogenization）处理对于仙台病毒在ELISA测试中抗原稳定性的影响。方法对BHK-21细胞内扩增培养的仙台病毒通过差速离心,富集后使用超声波做均质化处理,和未处理的病毒分别包被酶标板,使用标准免疫小鼠血清和SPF小鼠血清对包被平板进行测试,比较样品测试孔间测量数据的变异率。结果对免疫血清做梯度稀释,各梯度样品在未经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在1.97%～6.02%之间;在经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在0.53%～2.26%之间;SPF血清测量值的变异率均高于免疫血清;所有样品在经超声处理的病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率均较小。结论超声波处理有效的提高了仙台病毒抗原的均质性,在ELISA测试中提高了抗原的稳定性。     

活性增强的SEC2截短突变蛋白的构建及其生物活性研究

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2的截短蛋白SEC14-239中7和9位氨基酸对其超抗原和抗肿瘤活性的影响.方法:利用基因工程方法将SEC14-239中7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu后,获得截短突变蛋白SEC14-239M.体外细胞学实验对其超抗原活性和抗肿瘤活性进行分析.结果:突变蛋白SEC14-239M体外刺激小鼠T细胞增值活性较SEC14-239显著增强(P＜0.05),与未截短的SEC2相当(P＞0.05).在相同剂量条件下,SEC14-239M诱导的抗肿瘤活性尽管低于SEC2(P＜0.01),但要显著高于SEC14-239(P ＜0.05).结论:截短蛋白SEC14-239的第7和9位氨基酸突变后能显著增强其超抗原活性和抗肿瘤活性,但二者增强程度有差异.这一结果说明以定点突变改造SEC2截短体的活性是可行的,同时也暗示超抗原的T细胞增殖和诱导肿瘤细胞抑制并不完全关联.     

连续12年产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌感染分布及耐药性分析

目的了解产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌（KPN）的临床分布及耐药性,为临床合理选用抗菌药物提供依据。方法用常规方法,结合法国梅里埃公司的自动化细菌鉴定分析仪分离鉴定细菌;用K-B纸片扩散法进行药敏试验;用双纸片协同筛选法和酶抑制剂增强纸片法检测ESBLs。对中国医科大学附属盛京医院1999年1月至2010年12月期间临床分离的产ESBLs和非产ESBLs KPN菌株的临床分布及其耐药趋势进行回顾性分析。结果 KPN的ESBLs检出率分别从1999年的19.82%上升至2010年的49.34%;KPN主要分离于痰占52.4%,其次是血液占17.74%,主要来源于外科病区和新生儿病区;产ESBLs菌和非产ESBLs菌对阿米卡星、左氧氟沙星等非β-内酰胺酶类抗菌药物的耐药率均显著增高,差异具有统计学意义（P〈0.01）,对亚胺培南和美罗培南都保持高度敏感,耐药率均低于2%。结论 12年间ESBLs检出率总体呈上升趋势,产ESBLs肺炎克雷伯菌表达对包括非β-内酰胺类在内的抗菌药物多重耐药,对碳青霉烯类抗菌药物仍保持高度敏感性。     

DNA疫苗抗原提呈的传感器分子研究新进展

DNA疫苗进入细胞后,除了转译成蛋白质抗原,通过MHC分子进行内源性或外源性抗原提呈外,近年来还发现可直接与相应的被称为核酸传感器分子,如TLR9、DAI、AIM2、STING、DDX41解旋酶和RNA聚合酶Ⅲ等结合,继而激活不同的免疫信号通路.基于DNA疫苗的传感器分子和信号通路研制免疫佐剂,可有效增强DNA疫苗的免疫原性.     

以ISA720为佐剂甘氨酸作为保护剂的恶性疟疾疫苗AMA1的长期稳定性

<正>恶性疟原虫顶端膜抗原(AMA1)是恶性疟原虫无性繁殖血液期表达的蛋白,是恶性疟疾疫苗的候选抗原。AMA1蛋白是疟原虫FVO和3D7等位基因表达产物,恶性疟疾候选疫苗AMA1-C1/ISA720     

肠杆菌新解释标准指导临床用药的实用性

采用新旧肠杆菌的2种解释标准,分析肠杆菌的耐药性,比较2种解释标准的临床意义。收集本院2009至2010两年临床分离的912株大肠埃希菌、328株肺炎克雷伯菌,用Kirby-Bauer法作药敏试验,用WO-NET5.4软件先设置CLSI推荐的旧的肠杆菌解释标准,分析耐药性。再设置CLSI推荐的新的肠杆菌解释标准[1]修改头孢曲松、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南和亚胺培南的解释标准,分析其耐药性。用肠杆菌旧的解释标准分析常规检测分离出的大肠埃希菌236株产酶株;肺炎克雷伯66株产酶株;产酶株比非产酶株的耐药率高。用新的头孢菌素和氨曲南的解释标准:对于大肠埃希菌头孢曲松的耐药率提高5.2%;头孢他啶提高10.4%;头孢噻肟提高10.2%;氨曲南提高7.1%;对于肺炎克雷伯菌头孢曲松的耐药率提高6.7%;头孢他啶提高4.3%;头孢噻肟提高10.1%;氨曲南提高2.5%;未向临床报产酶株。采用碳青霉烯类抗生素新的解释标准大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药分别提高了0.4%和0.6%,对美罗培南的耐药率分别提高了0.2%和0.6%。新的肠杆菌解释标准更能客观分析肠杆菌的耐药性,对指导临床合理用药,控制耐药株的蔓延更具实用价值。     

白细胞介素-21与乙型肝炎病毒前S2S抗原融合蛋白在293T细胞中的表达

目的:构建白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)和乙型肝炎病毒前S2S抗原(S2S)的融合表达质粒,并研究其在293T细胞中的表达。方法:采用PCR方法扩增IL-21和HBV前S2S基因片段,分别克隆入pcDNA3真核表达质粒,用分子克隆方法构建融合表达质粒,并以脂质体2000转染293T细胞,分别应用ELISA法和Western Blot法检测细胞上清及细胞中IL-21和HBsAg的表达水平。结果:经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒内插入片段序列正确,三种重组质粒分别命名为pcDNA-IL-21、pcDNA-S2S和pcDNA-IL-21-S2S,并且重组质粒能在293T细胞内表达并分泌相关蛋白。结论:成功构建IL-21和乙型肝炎病毒前S2S抗原的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。