高温链霉菌质粒pTSC2的测序分析和滚环复制方式的鉴定

从猪粪堆肥中分离到一株编号为X3-3的可以在50℃高温生长的链霉菌菌株,该菌株含有一个约7kb的环型质粒pTSC2。【目的】克隆、测序和分析pTSC2,以及鉴定质粒的复制方式。【方法】利用分段克隆和引物延伸获得pTSC2的全序列,利用多序列比对寻找复制元件rep、dso和sso,利用中性转移和Southern杂交检测复制中间体。【结果】克隆和测序获得了全长为7516bp的pTSC2序列,预测编码8种蛋白,其中4种蛋白与链霉菌滚环复制的质粒pIJ101中负责复制和接合转移的蛋白非常相似。pTSC2的复制元件rep、dso和sso也与pIJ101的相似。克隆、转化变铅青链霉菌ZX7以及高温链霉菌2C证明了rep和dso为复制所必需元件。Southern杂交检测到pTSC2复制过程中积累了大量的单链DNA。【结论】高温链霉菌质粒pTSC2以滚环方式进行复制。这是首次在高温链霉菌中克隆和测序质粒,以及鉴定其复制方式。     

肝纤维化进程中miRNA-19b表达变化的研究

目的:观察微小RNA(miRNA)-19b在肝纤维化大鼠肝脏组织的表达,探讨miRNA-19b在肝纤维化进程中的作用.方法:将20只SD大鼠随机分成正常对照组和肝纤维化模型组.采用改良式复合因素法复制大鼠肝纤维化模型,分别在6、7周后,取各组大鼠肝脏组织,用荧光实时定量PCR方法检测miRNA-19b的表达.结果:6周后肝纤维化模型组大鼠肝脏组织miRNA-19b的表达低于正常对照大鼠组(P＜0.05),7周模型组大鼠肝脏组织miRNA-19b的表达低于6周模型组(P＜0.05).结论:miRNA-19b在肝纤维化大鼠肝脏组织中表达降低,可能与纤维化进程相关,且可能成为肝纤维的诊断以及预后的一个指标.     

一养殖场中质粒介导喹诺酮类药物耐药基因qnrS的流行特性

摘要:【目的】研究质粒介导喹诺酮类药物耐药基因qnrS在一养殖场中的流行特点。【方法】分离养殖场不同来源样品中的大肠杆菌菌株,利用美国临床标准委员会(CLSI)推荐的药敏纸片法测定菌株耐药情况,通过质粒接合试验获得qnrS阳性接合子,测定qnrS对喹诺酮类药物最小抑菌浓度(MIC)值的影响及其与其它类抗生素耐药性的相关性,利用脉冲场凝胶电泳分析该场中qnrS阳性菌株遗传进化关系。【结果】环境源菌株qnrS的阳性率为29.2%,显著高于禽源菌株基因检出率(13.4%),新进的雏鸡可迅速从养殖场中获得 qnrS基因并在鸡群中流行。qnrS基因可使接合子对喹诺酮类药物MIC值不同程度升高,并且与其它五类抗生素具有相关性,不同qnrS阳性菌株间遗传关系较远,但也存在同一克隆株的流行。【讨论】qnrS基因主要通过质粒的播散等进行水平传播,同时也存在同一克隆株的流行传播。qnrS基因多样性及其水平传播方式造成了它的广泛流行,加强对耐药基因的监测及研究对减少多重耐药菌株的产生具有重要意义。     

不同致病型马立克氏病病毒DNA聚合酶基因序列比较

为了分析马立克氏病病毒(MDV)致病型与其DNA聚合酶基因的关系,本研究比较了9个不同致病型的该基因的同源性关系,这包括四种不同致病型的国际参考株即弱毒疫苗株CV1988／Ripens株、强毒株GA、超剜毒株Md5和特超强毒株648A;中国疫苗株814、中国强毒参考株Jing-1及3个中国野毒株。结果表明：MDV的DNA聚合酶基因非常保守,在比较的9个毒株间,该基因上游约369个碱基的调控序列的同源性在96．7％～100％之间,该基因编码的1220个氨基酸序列的同源性在99．2％～100％之间。尽管不同毒株在一些位点上出现了氨基酸的变异,但这些变异与病毒的致病型或地域分布没有明显的关系。     

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

A型流感病毒的反向遗传技术研究进展

A 型流感病毒基因组为单股负义RNA,分为8 个片段。反向遗传技术即从克隆的cDNA 产 生病毒的过程,是研究RNA 病毒、也是研究A 型流感病毒基因结构与功能的新技术。介绍了A 型流感病毒反向遗传技术的发展,完全以质粒为基础的新操作系统及其在研究病毒的生命周期、 致病性、产生基因修饰的疫苗候选株等方面的应用。     

病毒分离和PCR-RFLP法对急性结膜炎标本中腺病毒感染及其型别的分析

目的分析2003年下半年收集的哈尔滨医科大学第一临床医学院急性结膜炎标本中的腺病毒(Adenovirus,AdV)感染情况及其型别。方法采集59例临床确诊为急性结膜炎患者的结膜拭子标本,在观察和分析接种细胞的病变(CPE)情况的基础上,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR—RFLP)法,特异性检测CPE阳性细胞中腺病毒核酸的存在情况,并对PCR阳性扩增产物进行病毒型别的分析。结果70．7％(41／59)的急性结膜炎标本接种于培养细胞后可以引起明显的CPE;其中,53．6％(22／41)的CPE阳性标本可以扩增出腺病毒核酸,RFLP分析证实68．18％(15／22)的腺病毒感染为Ad3型,31．82％(7／22)的腺病毒感染为Ad7。结论2003年下半年哈尔滨市急性结膜炎主要以腺病毒3、7型感染为主。提示结合病毒分离培养和PCR—RFLP方法,可以广泛应用于急性结膜炎相关的病毒感染及其型别的进一步分析与研究。     

PCR方法制备地高辛标记DNA探针检测中国对虾非包涵体型杆状病毒

A pair of primers created from information of PmNOBⅢ genome DNA Sal I fragment produced a 355bp band by using Penaeus chinensis non occluded baculovirus (PcNOBV),the WSBV isolate from P.hinensis in mainland China,as the DNA template.The specific PCR product was cloned,sequenced and labeled with digoxigenin (DIG)DNA labeling kit(Boehringer Mannheim).The DIG labeled fragment was tested by dot blot hybridization for sensitivity and specificity with purified PcNOBV nucleocapsid,PcNOBV infected shrimp tissues and healthy shrimp tissues.The detection limit of the DNA probe is 6.8pg of purified PcNOBV DNA.No hybridization signals were observed using DNA from healthy shrimp as template.Healthy P.chinensis,artificially infected P.chinensis and pond reared adult P.chinensis were screened for PcNOBV infection by both PCR and the hybridization assay.The results showed a good relationship between PCR and the hybridization assay.These findings demonstrate that the DIG labeled probe can be used as a sensitive,specific and cost effective reagent for detection of PcNOBV.     

人白细胞介素－3在大肠杆菌中的高效表达

人白细胞介素－３（ｈｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３,ｈＩＬ－３）是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用ＰＣＲ方法从人Ｔ淋巴细胞ｃＤＮＡ文库中扩增出０．４４ｋｂ的ＤＮＡ片段,并克隆入ｐＵＣ１９载体中。经ＤＮＡ序列测定,确定０．４４ｋｂ的ＰＣＲ产物合完整的编码人白细胞介素－３成熟蛋白ｃＤＮＡ序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ＡＴＧ起始密码。构建的ＰＬ启动子控制下的ｈＩＬ－３ｃＤＮＡ表达质粒,转入大肠杆菌Ｔａｐ１０６,经４２℃热诱导,获得ｈＩＬ－３的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为１５ｋｄ,约占细菌总蛋白的１５％。表达产物经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证。ｈＩＬ－３表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到７０．８％,产物复性后,能明显促进ｈＩＬ－３依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到ＰＶＤＦ膜后进行Ｎ端序列分析,Ｎ端１６个氨基酸正确。     

HL-60细胞内DNA甲基化作用与RNA聚合酶活力的关系

以 S-腺苷酰 - L-甲硫氨酸 ( SAM)为诱导物 ,在 1 0 μmol/L最佳浓度下可诱导 HL- 60细胞分化达 1 6%左右 .HPLC测定结果证明 ,诱导物处理后 HL- 60细胞 DNA甲基化水平升高 .通过 3 H-UTP同位素参入法 ,测定了不同处理时间和不同浓度 SAM对 HL- 60细胞 DNA模板体外转录活性的影响 ,发现体外活力下降 .比较了不同浓度α-鹅膏蕈碱存在下 RNA聚合酶活力的变化 ,结果表明 SAM处理后细胞中不同 RNA转录产物所占份额改变