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101.
[目的]构建可以大规模提取IL35的新型质粒p LVX-IRES-Zs Green1-mus-IL35。[方法]质粒p LVX-IRES-Zs Green1和p UC57-mus-IL35-拼接用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切,将回收纯化的目的片段mus-IL35-拼接(NotⅠ/XhoⅠ)与回收纯化的载体p LVX-IRES-Zs Green1(NotⅠ/XhoⅠ)连接,连接产物命名为p LVX-IRES-Zs Green1-mus-IL35-拼接。连接产物转化DH5α感受态细胞,涂布LB Amp平板,37℃温箱培养过夜。[结果]检测慢病毒p LVX-IL35滴度为:6×10~7TU/ml,提取质粒浓度为1~2 mg/ml。鉴定引物为测序的通用引物,上游引物和下游引物离MCS区域加上目的序列,目的PCR条带大约1 600 bp,送鉴定正确菌液测序。测序结果比对正确。[结论]采用新型超量无内毒素质粒提试剂盒,可以大规模方便快速提取相关质粒。 相似文献
102.
将单拷贝人α心钠素基因3′端用Ban Ⅱ酶解除去包括终止密码在内的36个碱基对,代之以人工合成的含Glu-Lys-Phe-Glu连接片段与另一单拷贝人α心钠素基因的5′端串连成编码60肽的双拷贝心钠素基因,克隆于大肠杆菌分泌型表达载体pIN-Ⅲ-OmpA_2质粒中,表达生成60肽的双拷贝人α型心钠素衍生物,在信号肽的作用下分泌至胞膜间质并自动切割为60肽的外源基因产物。分子量约8K的表达产物用分子筛或超滤膜分离后再经HPLC纯化,表达产物具有明显的心钠素放免活性和舒张血管活性。 相似文献
103.
104.
目的:改造大肠杆菌的代谢途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产异丁醇的能力.方法:将乳脂乳球菌NIZO B1157的2-酮酸脱羧酶基因kdcA克隆到大肠杆菌中,使大肠杆菌产异丁醇;另外,采取两种方法过量表达alsS、ilvC、ilvD基因,增加前体物质酮酸的供应,以提高异丁醇的产量:一是与kdcA串联表达;二是在另一个相容质粒中表达.结果:大肠杆菌工程菌具备产异丁醇的能力,其中相关基因在一个质粒中串联表达的产量比其在两个相容质粒中共表达的产量高30倍,达到3g/L.结论:导入的酮酸合成途径与醇类生产途径结合,能使非生产菌株大肠杆菌生产异丁醇,并且单质粒表达代谢途径相关基因的效果优于双质粒表达. 相似文献
105.
目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与PacoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl2·4H2O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达Pcdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝PAE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。 相似文献
106.
以质料pKT230为载体,亚克隆大豆根瘤菌吸氢酶结构基因(hupSL)片段,构建成嵌合质粒pKH1。将质粒分配系统基因(parDE)片段和吸氢酶结构粒pRKBH。质粒pKH1、pRKBH和载体pRK415经转化和三亲本杂交,得到DH5α/pHR11、DH5α/pRKBH、pRK415、NG1390/pHR11、NG1390/pRKBH和NG1390/pKH1(NGH982)等接合子。稳定性分析发现,质粒pKH1在催娩克氏杆菌中传80代后仍有92%以上的菌株含此质粒,说明质粒pKH1有较高的稳定性。吸氢酶活性分析表明,H2诱导接合子NGH999和NGH982吸氢酶活性高表达,同时固氮效率和固氮酶活性也高。低碳源浓度更有利于接合子吸氢酶活性的表达和固氮效率的提高。接合子NGH982具有耐铵的基因,因此其固氮酶活性的表达有部分去铵阻遏的作用。 相似文献
107.
芽孢杆菌原生质体的形成和质粒转化的研究 总被引:3,自引:2,他引:3
测定了芽孢杆菌属中21个种、68个菌株的原生质体形成率。在高渗缓冲液(SMMP 或SMN)中,原生质体形成率在90%以上的有37株。降低高渗缓冲液中钠离子浓度,有利于原生质体的形成。用质粒(pUB 110或pC194) DNA对16株芽孢杆菌的原生质体进行了转化试验。转化成功的共8株:纳豆芽孢杆菌AS 1.107、AS 1.921、幼虫芽孢杆菌AS 1.430、球芽孢杆菌AS 1.1362、迟缓芽孢杆菌#50、苏云金芽孢杆菌松蠋亚种AS 1.294、地衣芽孢杆菌# 18和坚强芽孢杆菌#28。原生质体在DM3再生培养基上的再生率分别为0.1%一19.2%,转化效率分别为1.4×102一1.0×105转化子/μgDNA。转化效率低或未转化成功的菌株,其原生质体的再生率一般都很低或不能再生,有的菌株在形成原生质体后发生自溶。 相似文献
108.
麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌1748的质粒Psmyi及其特性的研究 总被引:1,自引:6,他引:1
从大环内酯类抗生索麦迪霉素的产生菌生米卡链霉菌1748(Streptomyces,mycarofa-ciens1748)中首次分离到质粒pSMYl DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,测定pSMYl的分子量为7.17×106道尔顿。用限制性内切酶EcoRI、PstI、XhoI、SalI和BamHl酶切该质粒DNA,构成了pSMYl的限制性内切酶酶切图谱。EcoRI、Pstl对该质粒均只有一个切点。pSMYI能转化到变青链霉菌1326(S.lividansl326)菌株中能稳定地存在,且具有形成麻点(pock)的特性。 相似文献
109.
用简单的温和法消除乳链球菌Lactococcus lactis sub sp.Lactis Z270的乳糖-蛋白酶质粒pUCL22(54kb)。DNA普通琼脂糖凝胶电泳图和生化检验证明,变异菌株D16和D17的质粒pUCL22被消除了。脉冲电泳图表明,D16的染色体限制酶图谱与野生菌Z270的相似,但D17的染色体被质粒的蛋白酶基因多位点整合,从而改变了其染色体限制酶的酶切图。 相似文献
110.