含离子液体体系中固定化细胞转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸

研究疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)与醋酸-醋酸钠缓冲液两相体系中,固定化产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3细胞转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应,并与缓冲液单相体系作为对照.确定了在[BMIM]PF6/缓冲液两相体系中,最适离子液体加入比例、缓冲液pH、反应温度、底物浓度分别为10%、5.8、35℃和6.0mmol/L,在此条件下反应58h,甘草酸转化率为87.03%,比缓冲液单相体系提高了15.02%.离子液体循环使用8次后,回收利用率维持在85.28%.主产物GAMG和副产物甘草次酸(GA)在两相体系中得到有效分离,为后续产物分离带来便利.     

大孔吸附树脂柱层析分离淫羊藿甙的研究

本文通过考察八种大孔吸附树脂对淫羊藿甙的吸附分离性能,筛选出了AB-8树脂作为分离纯化淫羊藿甙的介质。对该树脂的吸附性能研究表明其对浸提物中的淫羊藿甙有良好的吸附选择性,静态饱和吸附容量和动态吸附容量分别为22．97和16．20mg／mL。通过柱层析实验确定了AB-8树脂分离淫羊藿甙的工艺,经一步层析可将淫羊藿甙的纯度从2．78％提高到27％,回收率达97．3％。     

一种优化翻译起始效率的方法

本文以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因作为目的基因,把包括PCNA基因5′端非翻译区(5′NTR)的24bp和编码38个氨基酸114 bp的顺序插入pTZ19R,构建与LacZ’5′端的融合基因。用寡核苷酸定点突变法在PCNA 5′NTR形成SD顺序,再用PCR法在SD顺序左右两侧分别随机突变6个和7个碱基,使它们与结构基因5′端顺序自发地形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化JM109(DE3),以T7 RNA聚合酶-T7启动子调控转录。对288个重组子的β-gal活性测定表明,不同重组的表达量可相差55倍,其中9个表达量不同的重组子的RNA dot blot证实它们在转录水平无明显表达差异。由此提示,该研究策略和方法能有效地改变目的基因的TIR二级结构和捕获具有高翻译起始效率的表达克隆。     

儿童呼吸道流感嗜血杆菌分离株耐药性与β-内酰胺酶基因研究

目的 调查儿童呼吸道流感嗜血杆菌分离株的耐药性和产β-内酰胺酶情况,研究分离株β-内酰胺酶基因的特征.方法 2011年1月到2012年6月,从儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌,用微量肉汤稀释法测定常用抗生素最低抑菌浓度;用Nitrocefin纸片法检测β-内酰胺酶;用PCR扩增结合限制性内切酶酶切分析对分离株β-内酰胺酶基因进行分型;比较TEM+菌株和ROB-1+菌株、TEM-1+菌株和TEM-2+菌株对常用抗生素的耐药性.结果 537株流感嗜血杆菌的β-内酰胺酶产酶率为52.3％(281/537);产酶株对氨苄西林、头孢克洛、头孢呋辛的MIC50、MIC90和耐药率明显高于非产酶株(P＜0.05);产酶株TEM基因阳性率为91.8％(258/281),其中90.3％为TEM-1型(233/258),7.4％为TEM-2型(19/258),ROB-1基因阳性率为8.2％(23/281);ROB-1+菌株对氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的MIC50和MIC90高于TEM+菌株,但头孢菌素类的MIC50和MIC90低于TEM+菌株;除头孢呋辛外,TEM-1+菌株和TEM-2+菌株对β-内酰胺类的MIC50和MIC90差异无统计学意义.结论 成都地区儿童呼吸道流感嗜血杆菌分离株β-内酰胺酶产酶率较高,产酶株主要携带TEM-1基因,对氨苄西林、头孢克洛和头孢呋辛等β-内酰胺类的影响明显.     

下丘脑室旁核β－内啡肽在大鼠烫伤休克中的作用

以１００℃沸水接触雄性大鼠去毛的背部２０ｓ,形成占体表面积２０％的三度烫伤。收集下丘脑室旁核推挽灌流液测定β－内啡肽免疫活性物质的含量;向下丘脑室旁核微量注射β－内啡肽或其抗血清,观察烫后心血管功能指标的改变及存活时间。结果表明,烫后下丘脑室旁核灌流液中β－内啡肽免疫活性物质含量显著升高,有两个峰值。烫后给予β－内啡肽抗血清,可显著改善心血管功能指标（ＭＡＰ,ｄＰ／ｄｔｍａｘ,Ｌｖｓｐ和ＨＲ）,延长存活时间;给予β－内啡肽则作用相反。上述观察表明下丘脑β－内啡肽的过量增多是促使休克加重和加快死亡的重要原因之一。     

应用杆状病毒载体在昆虫细胞系统中表达乙型肝炎病毒表面抗原基因

构建了同时带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体质粒pVL941lacHBS。应用磷酸钙沉淀技术将pVL941lacHBS DNA转入事先用AcNPV感染过的Sf9细胞,在显色剂X-gal存在下,筛选无多角体的蓝色蚀斑。经过若干次蚀斑纯化,最后获得含乙肝病毒表面抗原基因和β-半乳糖苷酶基因的重组杆状病毒R-AcV941LS。 用R-AcV941LS感染Sf9细胞,在感染后72～96小时,用RPHA和RIA分别检测组织培养上清液和细胞裂解液中的乙型肝炎病毒表面抗原含量。结果,组织培养上清液为3.83μg/1×10~6～2×10~6细胞;细胞裂解液为4.39μg/1×10~6～2×10~6细胞。乙型肝炎病毒表面抗原的合成总量为8.22μg/1×10~6～2×10~6细胞。免疫电镜观察显示表达产物呈约22nm的球形颗粒。小鼠免疫接种实验结果表明,以R-AcV941LS感染Sf9细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原与在哺乳动物细胞系表达的乙型肝炎病毒表面抗原具有相近似的免疫原性。     

鸽β-防御素5基因克隆及其抗菌活性

从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高,分别为87.9%和78.8%,这两组氨基酸序列的同源性为83.3%。因此,将其分别命名为鸽AvBD5α(骨髓)和鸽AvBD5β(肝脏)。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。两个重组融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,及其融合蛋白的溶血活性。结果表明,重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa。具有明显的抗菌活性,对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性显著影响。此外,这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性。     

地衣芽孢杆菌WS-6 β-葡聚糖酶基因的克隆及表达

β-葡聚糖是植物细胞壁中结构性非淀粉多糖,存在于各种饲料农作物中。作为一种抗营养因子,β-葡聚糖使食糜具有很高的粘度,阻碍肠道消化液与食糜的混合,影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收,降低饲料的利用率。地衣芽孢杆菌分泌的β-葡聚糖酶可分解β-葡聚糖。在青贮发酵过程中,这种酶可降解大麦β-葡聚糖,有效提高家畜、家禽对饲料的利用率。从地衣芽孢杆菌WS-6中克隆到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因并进行测序,将该基因与大肠杆菌表达载体pET32a进行连接,转化大肠杆菌BL21,使该基因得到了有效的表达,为进一步在食品级宿主菌中的表达奠定了基础。     

葡萄糖对体外培养椎间盘髓核细胞的影响

目的:探讨葡萄糖对体外培养髓核细胞的生物学特性的影响。方法:酶消化法分离培养正常椎间盘髓核细胞。对照组:DF12+20%FBS培养液(葡萄糖浓度1000mg/L)、无糖组:无糖DMEM+20%FBS(葡萄糖浓度0mg/L)培养液培养髓核细胞。HE染色观察细胞形态变化,计数板计数细胞总数,台盼蓝染色计算髓核细胞活性比率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hoechst33258染色观察凋亡细胞核的变化。结果:两组培养液培养细胞形态大体正常,并无明显变化。对照组细胞总数明显多于无糖组。细胞活性率对照组也高于无糖组。Hoechst33258染色凋亡细胞,凋亡细胞核内可见致密的颗粒状和块状荧光,细胞核形态不规则,少数细胞核碎裂,部分细胞核呈月牙形。结论:葡萄糖对椎间盘髓核细胞的增殖及凋亡有显著的影响。     

TGF-β1对话Hedgehog-Gli1信号调控肾小管上皮细胞表型转化和胶原累积

该研究旨在探讨Hedgehog-Gli1(HH)信号在肾小管上皮细胞表型转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和胶原累积中的作用及与TGF-β1信号的对话机制。该实验通过体外培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,以溶剂作为对照组,以1~50 ng/m L重组蛋白sonic hedgehog(Shh)或5 ng/m L TGF-β1作为诱导组,以加入或不加入HH信号特异性阻断剂环靶明(cyclopamine,Cyp)5μmol/L为干预组。细胞培养24 h,采用ELISA、q RT-PCR、免疫细胞荧光染色和Western blot等方法检测HH信号相关分子(Ptch1、Smo和Gli1)、TGF-β1、EMT相关分子(Rac1蛋白、肌成纤维细胞标志物α-SMA和上皮细胞标志物E-cadherin)、III型胶原m RNA或蛋白的表达。结果发现,外源性Shh上调Smo和Gli1表达,抑制Ptch1表达,继而激活HH信号;HH信号活化抑制肾小管上皮细胞E-cadherin的表达,上调α-SMA、III型胶原和TGF-β1的表达。环靶明干预后,Smo表达下调,进而抑制HH信号、EMT和胶原累积,并下调TGF-β1的表达。应用TGF-β1诱导小管上皮细胞EMT,同时也上调HH信号分子Smo和Gli1的表达,下调Ptch1的表达,提示TGF-β1可诱导HH信号活化。综上所述,HH信号和TGF-β1均参与了肾小管上皮细胞EMT和胶原累积过程。HH信号活化可促进TGF-β1的表达,同时TGF-β1能激活HH信号,推测TGF-β1与HH信号可能存在交叉对话以调控EMT和胶原累积。