Asia-Ⅰ口蹄疫病毒P1-2A基因真核表达质粒的构建及小鼠免疫试验术

目的：构建含有Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因的真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并用pVAXⅠ-P1-2A免疫小鼠,评价其体液免疫和细胞免疫水平。方法：通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDV P1-2A编码区的目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上。将pMD18-T-P1-2A和pVAXⅠ分别经EcoRⅤ和XbaⅠ双酶切后连接构建真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A。将酶切鉴定正确后的重组质粒转染HeLa细胞进行IFA检测。再进行小鼠血清特异性抗体试验、小鼠T淋巴细胞增殖试验和IFN-γ ELISPOT试验。结果：酶切结果与预期目的条带大小相符;荧光结果表明经pVAXⅠ-P1-2A转染的细胞有明显的黄绿色荧光,说明P1-2A基因在HeLa细胞中得到了表达;小鼠免疫结果表明,免疫的小鼠都产生了较强的体液免疫和细胞免疫,并且T淋巴细胞增殖数和产生IFN-γ的细胞数和对照组相比显著提高（P〈0．05）。间接ELISA试验表明,在免疫第14天抗体水平比对照组明显增高（P〈0．05）。结论：成功构建了真核表达质粒pVAXⅠ-P1-2A,并通过小鼠免疫试验发现重组质粒试验组能够诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疾应答。     

绿豆胰蛋白酶抑制剂┐猪胰蛋白酶复合物的四方晶体结构

本文报道了绿豆胰蛋白酶抑制剂－猪胰蛋白酶（１∶２）复合物的四方晶体的结构测定。晶体属于Ｉ４２２空间群,衍射分辨率为０．２５ｎｍ,共确定了绿豆抑制剂５６个残基的空间位置。与已报道的三方晶体结构相比,其中的抑制剂分子的结构基本相同,并且抑制剂－酶三元复合物在四方晶体中也处于堆积无序状态,即复合物按两种取向进行堆积：Ｔａ∶ＭａＭｂ∶Ｔｂ和Ｔｂ∶ＭｂＭａ∶Ｔａ（Ｔａ,Ｔｂ为胰蛋白酶,Ｍａ为抑制剂结合环Ⅰ,Ｍｂ为抑制剂结合环Ⅱ）。但四方晶体结构比三方晶体结构多测定了一个抑制剂残基Ｐｒｏ１１的位置,同时,四方晶体中的抑制剂不存在膺β－折叠片层结构,其构象与三方晶体中的抑制剂相比有所变化。分析表明抑制剂的两个刚性的结构域之间的连接肽具有一定的柔性,并因此形成不同的晶型。此外,绿豆抑制剂与其他Ｂｏｗｍａｎ－Ｂｉｒｋ抑制剂相比,分子的两个双股的反平行β－折叠片层和抑制活性位点所在的结合环的结构具有很高的保守性     

地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究：I.碱性蛋白酶高产菌的筛选及产酶条件初探

从成都佳丰食品厂等处采集的样品中平板分离初筛到１２４株碱性蛋白酶产生菌,进一步复筛出一株高产,且稳定的碱性蛋白酶产生菌株Ｂ．Ｌ．ＪＦ－ｌｄ初步鉴定为地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）。该菌的最适产酶条件为：培养基（％）为麦芽糖７．５,酵母膏３,ＮａＣｌ０．５,Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ０．５３,ＮａＨ２ＰＯ４·２３Ｈ２Ｏ０．０３,Ｎａ２ＣＯ３０．０５６,ＭｎＳＯ４ｌ×１０＾－４     

薄层层析-比色法测定降糖安胶囊中胡芦巴皂苷B的含量

建立薄层层析-比色法测定降糖安胶囊中胡芦巴皂苷B含量的方法。采用硅胶H薄层板,氯仿：甲醇：醋酸：水(25：12：2：2)为展开剂,在碘蒸气中定位,用高氯酸显色,325nm波长处检测,点样量在35ug～385ug范围内呈现良好的线性关系,其回归方程为A=285．6C-1．313,相关系数r=0．9991,平均回收率为96．23％,RSD=1．75％。本法准确,适用于该药的质量控制。     

pcsk9 siRNA对oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响

为研究pcsk9基因沉默后对氧化型低密度脂蛋(oxLDL)诱导THP-1源性巨噬细胞凋亡的影响,用不同浓度oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,RT-PCR、Western blot分别检测pcsk9 mRNA、NARC-1蛋白的表达.应用Lipofectamine2000转染3对pcsk9 siRNAs进THP-1源性巨噬细胞中,筛选出最有效的siRNA再转染入THP-1源性巨噬细胞,24 h后加入oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色观察细胞评价细胞凋亡,流式细胞术计数检测细胞凋亡率.结果发现,75 mg/L oxLDL处理THP-1源性巨噬细胞48 h后,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞.同时RT-PCR、Western blot检测发现,pcsk9 mRNA和NARC-1蛋白质表达量均随oxLDL浓度的增加而增加,75 mg/LoxLDL组增加最明显.不同浓度siRNA转染THP-1源性巨噬细胞后,RT-PCR筛选出3对siRNAs的终浓度为80 nmol/L均可出现明显的沉默效应.选取此浓度在蛋白质水平检测基因抑制情况,筛选出最有效的一对siRNA.将筛选出来的siRNA转染细胞24 h后,再用oxLDL处理48 h,Hoechst33258染色及流式细胞计数结果显示,转染siRNA组凋亡明显被抑制.结果表明,在本研究的浓度范围内,随着oxLDL浓度增加pcsk9的表达随之增加,同时,THP-1源性巨噬细胞凋亡也明显增加,75 mg/L oxLDL最明显,pcsk9 mRNA和蛋白质的表达也在该浓度最高.提示pcsk9 siRNA能有效抑制pcsk9基因的表达,从而有效抑制由oxLDL诱导的THP-1源性巨噬细胞的凋亡.     

细胞色素P450调节肝脏药物代谢的途径

大量研究认为细胞色素P450与药物性肝损伤的病理生理过程密切相关,对其在肝损伤的作用已成为当前研究的一个热点.主要介绍细胞色素P450与药物性肝损伤的相关研究进展.     

NF—кB在肺部疾病中的研究进展

核因子－кＢ是近年来发现参予肺部疾病（肺炎、肺癌、哮喘等）的重要转录因子,它参予了细胞因子,粘附因子、生长因子诸多因子的转录调控。本文就其与肺部疾病的密切关系及抑制其活化而减轻肺部疾病的研究进展作一综述。     

HIV-1感染长期不进展者的B细胞谱系研究进展

高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy, HAART)在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)感染方面取得了显著成效,但仍无法治愈艾滋病。研发出能够诱导中和多种HIV-1毒株能力的广谱中和抗体HIV-1疫苗,已成为防治HIV-1感染的重要目标。HIV-1感染长期不进展者是广谱中和抗体的主要提供者,阐明长期不进展者的B细胞谱系特征,将为广谱中和抗体成熟的相关研究奠定重要基础,为HIV-1疫苗研发提供新思路。现就HIV-1感染长期不进展者的B细胞谱系研究进展作一概述。     

稀有海洋放线菌Salinispora arenicola大片段DNA基因组文库的构建

目的：构建稀有海洋放线菌S.arenicola基因组文库。方法：以稀有海洋放线菌S.arenicola为实验材料,随机剪切提取的总DNA,5′-磷酸末端补平回收40kb左右的DNA片段,与pWEBTM载体连接,经包装蛋白包装成噬菌体后侵染宿主细胞E.coliEPI100,构建该菌株的基因组文库,并对该文库进行质量鉴定。结果：成功构建了稀有海洋放线菌S.arenicola的基因组文库,效价达6.5×104CFU/mL,得到3000个阳性克隆子,远远大于按覆盖率为99%计算至少所需的657个阳性克隆子数,且平均插入片段长度为36kb,重组率100%。阳性克隆子保存于96孔板中,-80℃保存。结论：所构建文库的各项指标均达到要求,为了进一步评估S.arenicola所能合成的所有潜在天然产物,还需要进一步检测该文库中包含有生物合成基因簇的大肠杆菌的表达情况。