肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的酶学表征及在催化合成α-熊果苷中的应用

将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase,诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液,将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明,重组SPase的比酶活为213.98 U/mg,纯化倍数为1.47倍,酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45℃,最适pH为6.5,该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L,Vmax为2.167μmol/(mL·min),kcat为39 237.86 min-1,利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷,最优条件为:氢醌添加量为40 g/L,蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1,重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH 7.0)中,反应温度30℃,避光反应24 h后终止反应,再用500 U/mL的糖化酶40℃处理2.5 h。α-熊果苷产量达98 g/L,氢醌的转化率接近99%。综上所述,文中克隆并研究了重组SPase,并建立了其在α-熊果苷生产中的应用。     

草鱼两个细胞因子信号抑制因子3基因序列及表达分析

细胞因子信号抑制因子3 (SOCS3)是一类调节免疫反应的蛋白, 为研究其在草鱼(Ctenopharyngodon idella)中的功能, 文章克隆了草鱼SOCS3b基因, 分析了SOCS3s基因在成鱼组织中的表达情况。序列分析结果显示, 草鱼SOCS3b基因全长2126 bp, 编码216个氨基酸。qRT-PCR结果显示, 草鱼SOCS3a和SOCS3b在成鱼11个组织中均有表达, 但表达略有差异。注射嗜水气单胞菌(Aerononas hydrophila)后, 草鱼SOCS3a和SOCS3b在肝、脾、肠、肾中的表达均有明显上升。以上结果表明SOCS3s基因在草鱼的组织生长调控中发挥着重要的作用, 且SOCS3s可以调节细菌诱导的免疫应答。研究将为后续草鱼SOCS3s基因的功能研究提供参考依据。     

斜带石斑鱼L-氨基酸氧化酶基因克隆及表达分析

鱼类的L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase, LAAO)具有广泛的抑菌杀虫效果, 为了解斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)LAAO基因序列特征及其在刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染后的表达变化, 该试验克隆得到2个石斑鱼LAAO基因: EcLAAO-1和EcLAAO-2, 它们的ORF长度分别为1536和1569 bp, 编码511和522个氨基酸, 均含有氨基酸氧化酶(Amino_oxidase)结构域以及LAAO保守序列: DBM和GG motif。多重序列比对显示石斑鱼LAAO与其他鱼类LAAO具有较高的相似性。系统进化树分析表明, 斜带石斑鱼的LAAO与硬骨鱼类亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测结果显示EcLAAO-1和EcLAAO-2在石斑鱼各组织均有表达, 其中皮肤、鳃、胸腺、肝脏和肌肉中含量较丰富; 在感染刺激隐核虫后, 鳃和脾脏EcLAAO-1, EcLAAO-2表达量显著升高(P<0.05), 这些结果暗示了石斑鱼LAAO参与先天性免疫, 并在抗御刺激隐核虫感染中发挥重要作用。     

白及蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

为揭示白及蔗糖合成酶基因与生长发育的关系,该研究以白及为材料,利用RT-PCR技术同源克隆白及蔗糖合成酶的关键基因SuSy,对SuSy基因的生物学特性及表达特征进行了分析,并利用实时荧光定量PCR检测SuSy基因在不同组织中的表达规律。结果表明:(1)白及SuSy基因长度为2 215 bp,编码737个氨基酸,与铁皮石斛、文心兰和蝴蝶兰的蛋白质氨基酸序列的相似性分别为97%、92%和95%。(2)生物信息学分析表明,SuSy蛋白质序列具有较高的亲水性,与拟南芥SuSy蛋白质氨基酸三级结构一致性为75.2%;系统进化树分析发现,白及SuSy蛋白与铁皮石斛处于同一个分支上。(3) qRT-PCR结果表明,SuSy基因在叶片中的表达量最高,块茎中的表达量最低;成熟叶片的表达量高于未成熟叶片的表达量;数据差异性分析显示,SuSy基因在根、块茎中表达量具有极显著性差异,但在一年生叶和二年生叶中的表达量无显著性差异,幼苗叶和一、二年生叶中表达量具有极显著性差异。由此推测,SuSy基因可能受生长发育的诱导,是调控白及生长发育关键基因。     

马铃薯StMYB44基因对蔗糖的响应

MYB转录因子存在于所有真核生物中,是最具代表的转录因子家族之一,广泛参与植物发育、苯丙烷代谢、生物与非生物胁迫响应、激素响应以及细胞形态建成等过程。该研究从马铃薯品种‘青薯9号’中克隆得到StMYB44基因(GenBank登录号XM_006367359.2),该基因CDS长为963 bp,编码320个氨基酸,含有2个SANT结构域。实时荧光定量PCR结果显示,StMYB44基因在花中表达最高,在匍匐茎中表达最低;且StMYB44基因在无蔗糖处理下表达上调,在高浓度蔗糖处理下(6%、9%)表达下调。构建表达载体并进行遗传转化烟草发现,StMYB44基因突变体在无蔗糖条件下的长势明显好于野生型,而在高蔗糖浓度下(6%、9%)的长势弱于野生型,且蔗糖浓度越高,差异越大。研究表明,蔗糖浓度能够调节StMYB44基因的表达,推测StMYB44基因可能在植物响应蔗糖中起重要作用。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

烟草水提物对果蝇寿命及有关基因转录的影响

探究烟草的水浸泡液对果蝇寿命与衰老情况的影响以及其中的分子机制。取羽化12 h内的新生W^1118系雄果蝇,分别培养于添加不同浓度烟草浸出液的培养基中处理,每日统计果蝇死亡情况;每7日提取对照组与最高浓度处理组果蝇全RNA,通过Real-time PCR检测过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、去泛素化酶(Rpn11)和去乙酰化酶(Sirt6)等与寿命有关基因的表达水平变化。结果显示,烟草影响使雄果蝇寿命显著缩短,且影响随烟草提取液浓度增加影响逐渐增大;烟草影响下果蝇的抗氧化基因出现显著上调,泛素化调节基因与去乙酰化基因等表达水平的变化均出现显著改变。表明烟草对果蝇的寿命情况有不利影响,可能通过引起氧化胁迫导致果蝇早衰。     

产瓦伦西亚烯酿酒酵母的表达载体适配及发酵碳氮源优化

瓦伦西亚烯是一种倍半萜类化合物,广泛应用于香水、香皂、食品和饮料等工业制造上。但由于其自然含量极低,且目前获取瓦伦西亚烯的方法较为麻烦且花费高,因而构建细胞工厂进行瓦伦西亚烯的生物合成是更为高效和环保的方法。选取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为宿主构建细胞工厂,先在酿酒酵母基因组上引入黄扁柏的瓦伦西亚烯合成酶(Valencene synthase from Callitropsis nootkatensis,CnVS),实现瓦伦西亚烯的初步合成,初始产量为4.16 mg/L。随后利用CRISPR/Cas9系统对酿酒酵母中Mevalonate(MVA)途径的erg9和rox1基因进行敲除,提高通往瓦伦西亚烯合成的碳流量。不同碳氮源浓度发酵的结果表明,细胞生长积累过高可能不利于瓦伦西亚烯的积累。最后探究了不同CnVS表达载体对瓦伦西亚烯产量的影响,并获得17.54 mg/L的最高产量,是出发菌株的4.2倍。     

甘肃省生境质量变化的图谱特征

生境质量是影响地区生态系统服务价值和保护地球生态系统中生物多样性的重要因素。以地处三大自然区交汇带的甘肃省为研究对象,在定量估算地区2000—2018年生境质量水平基础上,基于图谱变化分析理论和InVEST模型,探索地区生境质量时空分异格局及其图谱转移状态和变化强度。结果表明: 2000—2018年,甘肃省生境质量总体维持中等水平并略有提升,在空间上自北向南呈逐级递增的阶梯式变化特征,在数量上则高低并存;从图谱转移视角分析,甘肃省生境质量格局较为稳定,未发生状态转移的图谱单元占主导,而在发生了生境质量状态转移的图谱单元中,“较高较低”、“较高高”、“较高低”这6类状态间的互换转移最显著,空间分布也较为集聚; “北剧南和”是甘肃省生境质量变化强度的主要格局,自北向南依次为“强变区”、“复合区”、“温缓区”和“平和区”4类变化强度区。