马铃薯GBSS基因5‘侧翼区调控作用的研究

将０．４、０．８、１．６、２．９ｋｂＧＢＳＳ基因的５＇侧翼区与ＧＵＳ基因融合,构建了双元表达载体。０．８ｋｂＧＢＳＳ－ＧＵＳ通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达。以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯。Ｘ－Ｇｌｕｃ染色及ＰＣＲ结果证实已获得转基因植株。利用离体块茎诱导系统,ＧＵＳ表达用荧光进行定量检测,结果显示,２．９、１．６、０．４ｋｂＧＢＳＳ－ＧＵＳ的表达均以块茎明显高于茎段,达２￣１０倍。     

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1912 bp的启动子(AGPasep)序列.该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子.为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达.GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能.     

tPA突变体在哺乳动物细胞中的表达

利用携带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的pCI载体,实现tPA突变体(FrGGI)在CHO-dhfr^-细胞中的高效表达,获得高表达细胞株。采用分子克隆常规技术,将去除3’端非蛋白编码区的tPA突变体cDNA与pCI载体连接,构建真核表达载体pCI—tPA;采用阳离子脂质体转染法转染CHO-dhfr^-胞。经酶切及测序鉴定,证明所构建的质粒正确,转染CHO—dhfr细胞后,经过MTX加压筛选,得到了10株表达水平较高的细胞株,其活性可达每106细胞4000U／24h。以上结果为进行tPA突变体工程细胞株的筛选奠定了基础。     

黄花蒿内生放线菌A5次生代谢产物分离鉴定

通过硅胶、反相、凝胶等分离方法从放线菌A5发酵液乙酸乙酯萃取相分离得到4个化合物,采用MS、1H NMR、13C NMR、COSY等对其结构进行鉴定,分别是6-benzyl-3-isopropylpyrazin-2(1H)-one(1),N-(4-hydroxyphenethyl)acetamide(2),3-(4-hydroxyphenyl)-2-((2-oxotetrahydro-2H-pyran-3-yl)oxy)propanoic acid(3)和尿嘧啶(4)。其中3的波谱数据首次报道。生测结果表明,在样品浓度为0.1 mg/mL时,1、2和3的海虾校正死亡率依次是43.2%,38.3%,43.2%,表明均具有一定的细胞毒活性。     

抗鱼类病原菌的放线菌分离鉴定及其活性研究

为了研究鱼类疖疮病的生物防治方法,以引起鱼类疖疮病的病原菌杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)为指示菌,从土壤中筛选到对该致病菌有较强拮抗活性的放线菌I6,经16S rRNA分析鉴定为链霉菌(Strptomyces sp.)。链霉菌I6的次级代谢产物对杀鲑气单胞菌具有很强的抗菌活性且对鱼类无毒力,在鱼类疖疮病的治疗和防控中具有应用潜力。为了提高链霉菌I6抗菌活性物质的产量,对该I6菌株进行发酵条件优化,确定其最佳发酵培养基为AM3-1,最适初始pH为7～8,最佳培养时间为5 d,种子液最适菌龄为36 h。所有这些研究结果表明,链霉菌I6对鱼类疖疮病病原菌杀鲑气单胞菌有显著抑制作用,在渔业生物防治中有潜在的开发应用价值。     

ORP4L多克隆抗体的制备及其在蛋白质组学研究中的应用水

目的：原核表达并纯化人氧化固醇结合蛋白相关蛋白4（ORP4L）肽段,制备兔抗人ORP4L多克隆抗体,并利用其进行蛋白质组学研究。方法：应用PCR技术扩增人ORP4L382-485氨基酸（ORP4Lm）的基因序列并插入到PGEX-4T—1载体中,在大肠杆菌RosettaTM（DE3）中表达融合蛋白GST-ORP4Lm。利用所表达的融合蛋白中含有的GST标签进行亲和纯化。用所获得的纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得兔抗人ORP4L多克隆抗体。用Western blotting检测抗体免疫特异性。将亲和纯化后的抗体偶联到CNBr-actived sepharosC beads上,利用免疫沉淀的方法,通过质谱仪分析鉴定可能与ORP4L存在相互作用的蛋白质。通过West—ernblotting进一步确证特异性的相互作用蛋白。结果：在大肠杆菌中表达并纯化了GST-ORP4Lm重组蛋白,用其免疫新西兰大兔．成功制备了相应兔源多克隆抗体,Western blotting证实该抗体可以特异识别内源性及外源性的ORP4L蛋白。质谱分析和Western blotting的结果表明所制备的多克隆抗体可以用于蛋白质组学研究。结论：利用重组的GST-ORP4Lm融合蛋白成功制备了有良好特异性的ORP4L多克隆抗体,并可将其用于ORP4L的蛋白组学研究。     

离体培养生产次级代谢产物

根茎共培养生产高水平茛菪胺颠茄（Ａｔｒａｐａｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）和Ｄｕｂｏｉｓｉａｓｐｐ．产生的茛菪烷生物碱阿托品、天仙子胺和茛菪胺具有广谱的药理学效应。全世界茛菪烷销售量估计比阿托品和天仙子胶总和的１０倍还高。在植物中,天仙子胺主要由根产生,然后被转运到植物的气生部分,在那里由６－羟化酶催化转变为茛菪胺。发根土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）－转化的毛根培养物可产生能与完整植株产量相比的天仙子胺,但仅有非常少量的Ａ茛菪胺。在澳大利亚新南威尔士大学和Ｍｏｎａｓｈ大学,Ａ…     

香蕉肉桂醇脱氢酶基因的克隆及表达分析

肉桂醇脱氢酶(CAD)在木质素合成过程中起关键作用。通过RACE(rapid-amplification of cDNA ends)方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个肉桂醇脱氢酶基因,命名为MaCAD1(GenBank登录号为KF582533)。MaCAD1是香蕉MYB基因编码框全长cDNA,包含一个1 077bp的最大开放阅读框(ORF),编码358个氨基酸。蛋白质序列同源比对发现,其含有完整的醇脱氧酶的典型保守结构域,属于典型的CAD蛋白。系统进化树比对分析表明,MaCAD1与水稻OsCAD6(CAD39907)的亲缘关系较近。组织特异性研究表明MaCAD1基因组成型表达于香蕉各个组织。在耐病和感病品种中,MaCAD1均上调表达,但在耐病品种中MaCAD1在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种,表明MaCAD1基因在香蕉的抗病性中起着重要作用,MaCAD1可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。     

小麦PAL基因的克隆及赤霉菌诱导下的表达分析

利用苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalanine ammonia-lyase)基因保守区域从小麦抗赤霉病材料苏麦3号中克隆获得4个PAL基因,分别命名为Ta PAL1、Ta PAL2、Ta PAL3、Ta PAL4。4个基因的开放阅读框(ORF,open reading frame)长度分别为2142 bp、2016 bp、2118 bp和2139 bp,分别编码714个、672个、706个和713个氨基酸。基因序列比对发现其相似性达到88.35%,所编码的氨基酸相似性为91.92%,氨基酸序列分析表明4个基因都包含HAL-PAL结构域及PAL结构域。通过接种禾谷镰刀菌,利用荧光定量PCR对PAL基因进行表达分析发现,4个PAL基因全部为上调表达,其中Ta PAL2、Ta PAL3和Ta PAL4最为明显。PAL基因的上调表达,说明PAL基因在小麦抵抗赤霉病菌侵染的机制中可能起着重要作用。