盐单胞菌DSM 16354T中新型耐盐基因的克隆及解析*

目的: 嗜盐菌分布广泛且适应能力极强,为加强对嗜盐菌耐盐机制的探索与研究,从盐单胞菌Halomonas alkaliphila DSM 16354^T中筛选出潜在的与耐盐有关的基因,对其进行生物信息学分析,并验证相关蛋白的生理功能。方法: 利用基因文库筛选和功能互补相结合的方法,通过与大肠杆菌(Escherichia coli)盐敏感缺陷株KNabc(ΔnhaA、ΔnhaB、ΔchaA)的耐盐功能互补实验,筛选出具有耐盐功能的蛋白编码基因,并通过荧光猝灭恢复实验测定蛋白的逆向转运活性以及底物亲和力。结果: 筛选得到两个具有耐盐功能的蛋白编码基因,生物信息学分析结果表明该基因编码来自于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族功能未知的膜蛋白,分别命名为duf1和duf2。系统发育树分析结果表明,来自盐单胞菌DSM 16354^T中的DUF1、DUF2属于一个独立的分支,预测这两个蛋白可能是DUF1538家族转运蛋白的新成员。对DUF1和DUF2的生理功能进行分析,发现duf1和duf2单独表达时均不具有耐盐碱能力,而共同表达时则表现出显著的耐盐碱功能,表明DUF1和DUF2两个亚基共同支持了蛋白的耐盐碱功能。蛋白的逆向转运测定活性结果表明双组份蛋白DUF1-2具有Na⁺(Li⁺、K⁺)/H⁺逆向转运活性。结论: 筛选得到的基因duf1和duf2共同表达时具有盐碱耐受功能以及逆向转运蛋白活性,这为筛选出新的DUF1538家族转运蛋白基因和进一步探究DUF1538家族转运蛋白功能奠定了基础。     

牦牛miR-378前体克隆及组织表达分析

旨在克隆牦牛miR-378的前体序列,阐明其组织表达规律,结合bta-miR-378靶基因的生物信息学预测和分析,探讨miR-378在牦牛生长发育过程中的调控功能。采用PCR方法成功克隆类乌齐牦牛miR-378前体序列,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-378-3p在各组织中的表达模式,结合生物信息学软件TargetScan、DAVID以及数据库NCBI、miRbase等对miR-378进行保守性分析、靶基因预测及其生物学功能分析。结果表明,miR-378在各物种间高度保守,且miR-378-3p在各组织中广泛表达,其中在臀大肌中表达水平最高,显著高于其他组织(P<0.01),在臀脂中的表达高于卵巢、大脑、乳腺和肝脏。获得的272个靶基因主要参与细胞分化、细胞发育、大分子代谢等多个生物学过程,涉及孕酮介导的卵母细胞成熟、促性腺激素释放激素(GnRH)信号通路等,由此推测,miR-378可能在卵泡发育、卵母细胞成熟过程中起关键作用,进而影响母牦牛的繁殖性能。     

附生蕨类植物的克隆性研究进展

石松类及蕨类植物在高等植物中处于比较特殊的进化与系统发育地位, 同时具有孢子植物(孢子)与种子植物(维管束)的双重特征。附生蕨类植物是蕨类植物中占据独特生境的一个大类群, 其生活史策略及进化历史与其附生生长的森林生态系统紧密相关。大部分附生蕨类植物的克隆生长习性及克隆生活史性状在其生态适应中具有重要作用, 但这方面未引起广泛关注。本文主要综述了中国山地森林中附生蕨类植物的根状茎克隆生长、克隆性与生态适应性、不同克隆生长方式与进化等方面, 并展望了蕨类植物克隆性在森林生态系统过程与功能中的作用, 以及今后如何将蕨类植物生态学研究与气候变化、植被恢复、土地利用变化等全球变化的主流方向进行结合。     

底座入土深度和面积对典型草原土壤呼吸测定结果的影响

生态学家对土壤呼吸开展了大量研究, 但很少评估“底座”对土壤呼吸测量结果的影响, 特别是底座入土深度和面积对土壤呼吸测定结果的影响。为此, 该研究在内蒙古典型草原设置了2个底座面积(15 cm × 15 cm和30 cm × 30 cm)和2个底座入土深度(2 cm和5 cm)处理, 采用气室法在植物生长季对土壤呼吸进行了测定, 分析评估了底座面积和入土深度对土壤呼吸测定结果的影响。结果显示: 与底座入土较浅和面积较小的处理相比, 底座入土较深和面积较大的处理, 土壤呼吸测定值分别降低了8.0%-9.7%和9.1%-10.8%; 这两个处理的底座内土壤温度显著升高, 土壤含水量显著下降, 地上净初级生产力显著降低。结构方程模型分析表明, 底座入土较深、面积较大的处理, 主要通过降低地上净初级生产力和土壤含水量, 增加土壤温度, 使土壤呼吸下降, 各因子共同解释了土壤呼吸变异的89%。研究发现, 在使用气室法测定土壤呼吸时, 底座入土深度和面积对土壤呼吸测定结果具有显著影响, 评估底座处理效应对准确测定土壤呼吸强度具有重要的意义。理论上, 适当降低底座入土深度和底座面积大小, 将有助于准确测定土壤呼吸。但在实践中, 由于土壤异质性的影响, 减少底座面积可能会增加新的测量误差, 只能考虑适当降低底座入土深度。     

树鼩PSEN1全长编码序列的克隆及分子特征分析

目的 获取树鼩早老素蛋白-1(PSEN1)的全长编码序列并进行分子特征分析。方法 以树鼩脑组织总RNA为材料,通过RT-PCR、RACE-PCR扩增和序列拼接获得PSEN1基因全长编码序列,进而通过DNAMAN、MEGA等生物信息学软件对其序列和分子特征进行分析。qRT-PCR和Western Blot进一步分析PSEN1在树鼩各个组织的表达模式。结果 克隆鉴定了树鼩PSEN1基因,其cDNA的开放阅读框全长1128 bp,编码375个氨基酸。通过系统发育谱系树、氨基酸序列对比分析,发现树鼩PSEN1与小鼠、大鼠等相比更接近人类和非人灵长类动物。qRT-PCR和Western Blot的结果表明,树鼩PSEN1在脑组织的表达量明显高于其他脏器组织。结论 通过克隆树鼩PSEN1基因序列并进行分析,为今后进一步深入研究该基因功能和建立相关疾病动物模型提供理论基础。     

篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802来源的高温葡萄糖淀粉酶性质与结构

葡萄糖淀粉酶作为淀粉糖化的关键用酶之一,广泛应用于食品、医药和发酵工业等行业。由于整个制糖过程都是在高温下完成的,因此对葡萄糖淀粉酶的反应温度和热稳定性有较高要求。本研究从嗜热篮状菌Talaromyces leycettanus JCM12802中克隆到一个糖苷水解酶第15家族(GH15)葡萄糖淀粉酶基因(Tlga15A)并在毕赤酵母GS115中实现异源表达。重组葡萄糖淀粉酶TlGA的最适pH为4.5,在75℃下表现出最高酶活。TlGA热稳定性好,65℃条件下处理1 h剩余70%以上酶活力;70℃处理30min后仍有43%酶活力。TlGA有较强的离子抗性和宽泛的底物特异性,TlGA水解可溶性淀粉、支链淀粉、糖原、糊精和普鲁兰的比活力分别为(255.6±15.3) U/mg、(342.3±24.7) U/mg、(185.4±12.5) U/mg、(423.3±29.3) U/mg和(65.7±8.1) U/mg。从葡萄糖淀粉酶TlGA的一级结构、二级结构和三级结构3个层面对其进行比较分析,发现一级结构中较少的Gly组成和三级结构中较低的非极性基团溶剂可及表面积可能是维持葡萄糖淀粉酶TlGA温度稳定性的主要原因。综合其性质特点和对结构的分析,葡萄糖淀粉酶TlGA在工业葡萄糖生产中有较大应用潜力。     

天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因 (ScTreS),在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中进行了异源表达,通过 Ni-NTA 亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经 SDS-PAGE 测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35 ℃;最适pH 7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5 L罐发酵,结果表明：在麦芽糖浓度300 g/L、初始反应温度和pH分别为35 ℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700 g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98 g/L。     

克隆整合和石油污染对芦苇湿地土壤理化性质的影响

克隆整合是克隆植物重要的性状之一。它不仅能够提高分株对环境胁迫的耐受能力,而且可能影响分株周围的土壤属性。为检验克隆整合对土壤属性的影响,在黄河三角洲芦苇湿地开展克隆整合和石油污染的两因子的野外实验。每年将0、5或10 mm厚的原油添加到直径为60 cm的圆形芦苇群落样方内来模拟无污染、轻度或重度石油污染,并通过保留或切断样方内外芦苇根状茎的连接来实现克隆整合的有或无。实验开始于2014年,并于2016年10月采集样方内土壤样品,测定土壤团聚体组成、pH值、电导率、总碳、总氮、总磷和有机碳含量。石油污染显著增加了土壤粗大团聚体(粒径:2 mm)、pH值、总氮和有机碳含量,降低了土壤微团聚体(粒径:0.053—0.25 mm)占比以及电导率。克隆整合显著降低了土壤pH值,提高了土壤电导率和氮磷比。克隆整合和石油污染的交互作用仅对电导率有显著效应。因此,石油污染和克隆整合都可以影响湿地土壤的理化性质,而克隆整合对分株周围土壤理化性质的影响可能进一步影响克隆植物的优势度。     

桑树MaGPX家族基因的克隆及表达分析

谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases, GPXs)是植物细胞清除活性氧的重要酶类之一,与植物的抗逆性紧密相关。该研究以桑树(Morus alba L.)‘红果2号’为材料,利用RT PCR方法克隆了桑树MaGPX基因家族6个成员。生物信息学分析表明,MaGPX蛋白序列具有植物GPX的典型结构域和Cys残基,并与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtGPX蛋白序列具有较高的相似性。亚细胞定位结果表明,MaGPX1/2/3/6可能定位在细胞膜、细胞质和细胞核,MaGPX4定位在叶绿体,MaGPX5可能定位在细胞膜,暗示桑树MaGPX成员具有功能的分化。qRT PCR分析表明,MaGPX基因家族各成员在芽、叶、根、雄花、雌花以及果实中均有表达,其中MaGPX1/3/5在根以及雄花中高表达,MaGPX2在雄花中高表达,MaGPX4在叶和雄花中高表达,MaGPX6在果实中高表达;MaGPX各成员的表达受干旱胁迫诱导,各成员对干旱胁迫的响应随着处理时间和胁迫程度的变化而有所不同,其中MaGPX1、MaGPX2和MaGPX3可能在清除活性氧和维持细胞内氧化还原平衡中发挥重要作用。该研究结果为桑树MaGPX基因家族的生理功能研究奠定了良好基础。     

马铃薯糖转运蛋白基因的克隆及表达分析

植物SWEET基因家族是一类糖转运蛋白,在植物的生理活动和生长发育过程中发挥着重要功能。为了解马铃薯SWEET基因的相关信息,探究其在马铃薯不同组织以及在生物胁迫与非生物胁迫下的表达特性。该研究采用同源克隆技术从马铃薯‘青薯9号’中克隆了StSWEET5基因(GenBank登录号为MN295671),其CDS序列长度为717 bp,编码238个氨基酸。系统进化树分析结果表明,StSWEET5与番茄的氨基酸序列相似性最高(97.06%)。qRT-PCR分析表明:StSWEET5基因在马铃薯各组织(根、茎、叶、花、块茎、匍匐茎)中均有表达,且在花中的表达显著高于其他组织;糖胁迫下,StSWEET5基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达差异最为显著(P0.05)。在晚疫病菌(Phytophthora infestans)诱导后36 h时,表达量达到最高,随后急剧下调。推测StSWEET5基因参与了马铃薯糖胁迫以及响应了晚疫病诱导的过程。