普通烟草NtODB基因的电子克隆、表达及生物信息学分析

ODB基因在植物同源重组依赖性的DNA双键断裂修复过程中起重要作用,对植物诱变育种具有潜在的应用价值。克隆烟草NtODB基因并分析其表达特征为丰富ODB基因在同源重组DNA修复过程中的作用提供证据。为得到烟草NtODB基因序列,采用电子克隆技术获得该基因cDNA序列并克隆验证。进一步使用生物信息学方法分析该基因表达特征,对预测蛋白的理化性质、信号肽、高级结构等进行预测。生物信息学分析结果表明,NtODB基因开放阅读框包含579个碱基,蛋白含192个氨基酸残基,NtODB蛋白具有碱性和亲水性,主要定位于细胞质内;实时荧光定量PCR检测结果显示NtODB基因在不同组织中呈现组成型表达特征;亚细胞定位检测提示NtODB主要表达于细胞膜和叶绿体。NtODB基因的克隆与表达分析及其蛋白高级结构和理化性质的预测,可为进一步丰富ODB基因在同源重组依赖的DNA修复系统中的作用机制提供证据。     

水稻长日照开花因子Lfm1的图位克隆

开花期是水稻最重要的农艺性状之一,水稻的花期决定着水稻的地区适应性和最终产量。人工选择使水稻从短日照向长日照、低纬度向高纬度扩张,因此水稻已逐渐进化出适应长日照条件下的开花调控机制。目前,虽然鉴定了一些影响水稻长日照的开花基因如SDG724、RFT1、EHD4、DTH2,但是挖掘水稻长日照开花基因还十分有限。本研究通过筛选水稻突变体库,获得一批在长日照下花期有显著差异的突变体材料,其中一份突变体lfm1(late-flowering mutant1),在长日照条件下开花延迟,在短日照条件下开花时间正常。通过图位克隆,将Lfm1基因初定位至第8染色体端粒附近。进一步的精细定位将Lfm1基因定位于分子标记8-0.269和与8-0.283之间,范围为12 kb,该区域包括3个候选基因。经测序分析发现,在突变体lfm1中,LOC_Os08g01420基因的第六外显子2800处缺失9个碱基,突变体lfm1等位于已报道的突变体ehd3。在适度(中日照条件下,~12 h/12 h)的光照条件下,突变体lfm1表现为穗粒数增多,生育期略延长,具有应用于生产的潜力。Lfm1基因的克隆为培育适应不同生态区域的水稻材料提供了重要的基因资源。     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆与生物信息学分析

根据已报道的植物鲨烯环氧酶(SE)基因特异性引物克隆竹节参SE基因.结果表明,克隆得到竹节参SE全长为1 632 bp,编码539个氨基酸,命名为PjSE.生物信息学分析指出,PjSE基因的氨基酸序列与人参属植物人参、三七、越南人参的同源性依次为99％、98％和98％.推测PjSE基因定位于线粒体(mTP)、叶绿体(cTP)和分泌途径(SP).PjSE基因存在保守结构域FAD结合位点,含4个跨膜结构域和7个motif结构位点.PjSE蛋白二级结构以无规则卷曲(Random coli)和α-螺旋(Alpha helix)为主要结构元件,延伸链(Extended strand)和β转角(Beta turn)分散于整个蛋白质中,百分比依次占40.82％、37.48％、15.77％、5.94％;该蛋白能折叠形成典型的三维结构.     

家蝇Phormicin A多克隆抗体的制备及效价检测

家蝇Phormicin作为防御素家族的成员,是一类具有广普抗菌活性的抗菌肽.本研究采用原核表达法表达并纯化获得了家蝇PhormicinA蛋白.将家蝇Phormicin A原核表达蛋白与完全佐剂和不完全佐剂乳化混匀,先后免疫新西兰白兔获得其多克隆抗体.通过原核表达蛋白中和吸附实验,以及Western blot实验验证了抗体的特异性.进一步用金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫样品,进行内源性验证并测定抗体的效价.结果 显示,该多克隆抗体既可以识别家蝇Phormicin A原核表达蛋白,也可以识别金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫产生的内源性Phormicin A蛋白.本研究为进一步探索Phormicin在家蝇天然免疫和防御中的机制等后续工作打下基础.     

昆虫病原菌(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI克隆及生物信息学分析

本研究旨在对昆虫病原菌玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)查尔酮异构酶基因CHI进行克隆、测序及相关生物信息学分析.序列分析结果显示:IfCHI基因编码区全长为1152bp,编码383个氨基酸,理论等电点(pI)D为9.72,属不稳定水溶性蛋白,其二级结构为混合型,蛋白质溶剂可及性主要分为三类,三级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲组成,同源序列分析及多重序列比对分析存在明显的差异.该昆虫病原菌玫烟色棒束孢IfCHI编码基因的成功克隆及生物信息学分析,为进一步研究病原菌CHI基因的遗传特性和表达机制以及为寻找更多的查尔酮类化合物提供了理论基础.     

南美蟛蜞菊内参基因Actin的克隆及其分析

看家基因Actin常被用作定量、半定量PCR试验的内参基因.为研究其他基因在南美蟛蜞菊响应环境变化的表达调控机制,根据GenBank上已登录的肌动蛋白基因(Actin)的同源核苷酸保守序列,设计特异性引物,利用RT-PCR的方法克隆获得了南美蟛蜞菊Actin基因的全长序列,并将该序列命名为WtAct.序列分析结果表明WtAct基因全长为1 134 bp,编码377个氨基酸,且与已发表的蓖麻、麻风树、青葙、向日葵等植物的核苷酸序列同源性分别在82.9％～93.6％,与这些植物的氨基酸序列相似度在94.0％～99.7％,其中南美蟛蜞菊WtAct与向日葵Actin基因的氨基酸序列相似度最高,达到了 99.7％.进化树分析也表明,两者的同源性最高.采用RT-qPCR方法检测以WtAct为内参基因时南美蟛蜞菊热休克蛋白基因HSP70在不同处理条件下的表达情况,表明HSP70的确受到不同环境变化的诱导表达,说明WtAct可以作为有效的内参基因.这些结果为深入研究南美蟛蜞菊相关功能基因的表达提供了理论基础,也为其他非模式植物Actin基因的克隆提供了借鉴.     

九香虫保幼激素环氧水解酶基因克隆、生物信息学及表达分析

[目的]保幼激素环氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)是昆虫体内保幼激素(Juvenile hormone,JH)的主要降解酶.本文旨在分析九香虫Aspongopus chinensis Dallas保幼激素环氧水解酶基因序列(AcJHEH)信息,探索其在九香虫生长发育过程中的作用.[方法]以九香虫成虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得AcJHEH基因序列,并利用生物信息学软件对其编码蛋白的理化特性、结构特征和系统进化进行分析;采用qRT-PCR技术检测并分析九香虫不同龄期和不同组织中AcJHEH的相对表达量.[结果]成功获得了AcJHEH的完整开放阅读框ORF序列,全长均为1 363 bp,共编码453个氨基酸,预测分子量为51.74 ku,等电点(pI)为7.66,分子蛋白式C2414H3683N581O653S14,含有N-端跨膜基序XWG、催化三联体、保守基序HGWP和2个酪氨酸,属于环氧水解酶家族.系统进化树分析表明,AcJHEH与茶翅蝽Halyomorpha halys的JHEH聚为一支,再与同为半翅目的臭虫Cimex lectulariu和绿盲蝽Apolygus lucorum的JHEH聚为一类.荧光定量PCR结果显示,AcJHEH在九香虫不同发育阶段和各组织中均有表达,且脂肪中的表达量极显著高于其它组织(P＜0.001);滞育九香虫成虫表达量最高,其次为4-5龄若虫都极显著高于其它发育阶段(P＜0.001).[结论]九香虫JHEH属于环氧水解酶家族,确定为保幼激素环氧水解酶.依据qPCR结果推测AcJHEH通过改变九香虫体内保幼激素浓度来影响九香虫4-5龄若虫蜕皮发育、成虫生殖系统发育和滞育等.     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测

Fbxl5为F-box基因家族的一员,目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段,将其克隆入表达载体pET-28a,转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测,获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达,通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体,为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。     

二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明AlepOrco能够在大肠杆菌Escherichia coli中高效表达。利用制备的多克隆抗体对二点委夜蛾AlepOrco进行Western blot检测,其能够特异识别成虫触角中AlepOrco蛋白。qPCR结果表明,AlepOrco在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织间具有相似的表达模式,都是在触角中的相对表达量最大,在翅中的表达量最小。【结论】克隆并原核表达了二点委夜蛾非典型嗅觉受体基因AlepOrco,制备的多克隆抗体能够特异识别二点委夜蛾成虫触角中的AlepOrco。结果为深入了解二点委夜蛾AlepOrco基因的结构和功能奠定了基础。