华法令诱导大鼠体内主动脉的钙化作用

目的:研究华法令对大鼠体内主动脉的钙化作用。方法:采用华法令(3 mg/g饲料)的饲料喂养诱导大鼠体内动脉钙化。实验分3组(n=6),对照组、6 W钙化组、12 W钙化组。Von Kossa染色观察钙结节形成,邻甲酚酞络合酮比色法定量测定钙沉积含量。采用TUNEL染色法检测大鼠主动脉组织内血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)凋亡。Western blot法检测大鼠主动脉组织中生长抑制特异蛋白6(Growth Arrest Specific Gene 6 Protein,Gas 6)蛋白表达水平。结果:钙化组钙结节、钙沉积含量及VSMC凋亡均高于对照组(P0.01)有显著差异。钙化形成与凋亡表达呈显著正相关(R2=0.8853,P0.0001);钙化组Gas 6蛋白表达量较对照组下调(P0.01)有显著差异。结论:华法令通过下调Gas 6蛋白诱导大鼠体内主动脉钙化形成。     

高温胁迫对Bt棉铃壳中Bt蛋白含量及氮代谢的影响

以Bt基因来源于中国的棉花品种泗抗1 号(常规种)、泗抗3 号(杂交种)和来源于美国的棉花品种99B(常规棉)、岱杂1 号(杂交棉)为材料,研究了不同高温水平下Bt 棉盛铃期铃壳中Bt 蛋白含量变化及氮代谢生理特征.结果表明: 铃壳中Bt 蛋白含量随温度升高而降低,与对照相比(32 ℃),常规棉品种在38 ℃、杂交棉品种在40 ℃以上时,铃壳中Bt 蛋白含量大幅度下降.其中,常规种泗抗1号和99B在38 ℃时分别下降53.0%和69.5%;杂交种泗抗3号和岱杂1号在40 ℃时下降64.8%和54.1%.铃壳Bt 杀虫蛋白含量下降显著时,其可溶性蛋白含量明显下降,游离氨基酸含量明显提高,GPT活性显著下降,蛋白酶活性显著增加.高温影响铃壳的氮代谢引起Bt蛋白的分解加剧,合成减弱,从而造成Bt蛋白含量减少,抗虫性下降.     

饥饿及雨蛙素诱导的AR42J 细胞中自噬基因LC3及beclin-1 表达的变化

目的:观察饥饿及雨蛙素诱导的大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中自噬基因LC3及beclin-1表达的变化,初步探讨吞噬(autophagy)在急性胰腺炎中的作用。方法:选择体外培养的生长状态良好的大鼠胰腺腺泡AR42J细胞,随机分为3组,饥饿组(N=10),雨蛙素处理组(N=10),空白对照组(N=10)。饥饿组加入充足的平衡盐溶液,雨蛙素处理组加入含10-7mol/L雨蛙素的全营养培养液,空白对照组加入含20%灭活胎牛血清的F12-K培养液(p H7.2-7.4),各组分别于处理后2、4、6 h收集细胞并提取蛋白质。采用免疫印迹法检测三组不同时点胰腺腺泡细胞AR42J中自噬基因Beclin-1和LC3的蛋白表达。结果:空白对照组不同时点beclin-1和LC3-II均呈低表达,且各时点比较差异无统计学意义(P<0.05)。饥饿组和雨蛙素处理组beclin-1和LC3-II的表达随处理时间的延长逐渐增加,且不同时点beclin-1和LC3-II的表达均较空白对照组显著增高,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论:雨蛙素和饥饿刺激可导致大鼠胰腺腺泡细胞AR42J中LC3-II及beclin-1蛋白表达随作用时间的延长而增加,自噬可能参与了胰腺炎的发生发展过程。     

鸭疫里默氏杆菌RecA作为一种内参蛋白的评价

由于缺少适合的内参蛋白,所以用Western blot的方法来研究鸭疫里默氏杆菌蛋白表达的调节尚未见报道。以鸭疫里默氏杆菌基因组为模板,PCR扩增含有组氨酸标签His-tag的rec A基因和截段的rec AP基因,并分别将其克隆于原核表达载体p ET32a。将重组质粒转化到表达菌Rosetta中,经1mmol/L的IPTG诱导进行蛋白质表达。用组氨酸标签亲和试剂镍-琼脂糖进行重组蛋白质的纯化。用纯化的重组蛋白对4周龄的昆明鼠进行免疫,制备多克隆抗体。Western blot实验表明,截段表达的Rec AP的多克隆抗体血清比全长Rec A蛋白的多克隆抗体血清与鸭疫里默氏杆菌总蛋白反应更特异;在铁离子限制性环境和血红素丰富环境中培养的鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白表达量一致。因此,鸭疫里默氏杆菌的Rec A蛋白可以在铁离子和血红素代谢等研究中作为Western blot的内参蛋白。     

断眼天牛DNA条码试剂盒的研制

【目的】为了加强对检疫口岸截获木材中的断眼天牛种类进行准确、快速的鉴定,克服单纯依赖于形态学方法为主的局限性,我们研发了断眼天牛属DNA条码试剂盒检测技术。【方法】本研究基于线粒体COⅠ基因(线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ),采用加拿大条码中心开发的昆虫及植物DNA提取方法,对基因序列分析,获得碱基位点规律。【结果】断眼天牛属中的9个常截获种类取得了标记性碱基位点。【结论】检疫中常截获的断眼天牛属中的9个种通过标记性碱基位点得到区分;研发了断眼天牛属DNA条码试剂盒检测技术,为进出境口岸的检疫工作提供一种新的鉴定手段。     

金黄色葡萄球菌凝集因子B的原核表达及其抗血清调理吞噬活性

金黄色葡萄球菌是导致医院院内感染的主要病原。由于金黄色葡萄球菌极易产生抗药性,因此疫苗免疫是预防该细菌感染的主要手段。作为一个粘附分子,凝集因子B(ClfB)的作用是使金黄色葡萄球菌能够在宿主黏膜定植,是预防该菌感染的一个重要的靶分子。本研究成功地在大肠杆菌中表达了可溶的ClfB N1-N3结构域蛋白(Truncated-ClfB),并且利用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤技术对其进行了纯化。用纯化后的Truncated-ClfB免疫新西兰大白兔,收集三免后的血清检测其抗体水平并且利用流式细胞术检测抗血清的调理吞噬活性。检测结果表明,三免后的兔源Truncated-ClfB抗血清抗体效价高达1:640 000;与免疫前兔源血清相比,兔源Truncated-ClfB抗血清能够显著增加多形核白细胞(Polymorphonuclear leukocytes,PMN)对金黄色葡萄球菌的吞噬效率(P0.01)。结果表明Truncated-Clf B有希望作为金黄色葡萄球菌疫苗的候选抗原。     

β-肾上腺素受体调节蛋白及其功能

血管疾病成为威胁人类健康头号杀手,心血管受体在心血管疾病的发生、发展及预防和治疗中具有举足轻重的地位。β-肾上腺素受体作为G蛋白偶联受体家族的成员,是心血管药物最重要的靶点之一。β-肾上腺素受体阻滞剂被认为是继洋地黄后药物防治心脏疾病的最伟大突破,其在心血管领域的研究和应用一直是被关注的热点。2012年度诺贝尔化学奖再次授予了β-肾上腺素受体的研究。随着研究的深入,人们发现β-肾上腺素受体接受着细胞内调控蛋白的精密调控,不同调控蛋白介导着受体不同的生理信号通路和病理性信号通路。基于这些发现,近年来提出了受体功能选择性的配体药物,这也将成为未来药物的研究方向。本文综述了β-肾上腺素受体调节蛋白及相关信号通路及功能。     

重组骆驼蓬脂转移蛋白对宫颈癌HeLa细胞化疗的增敏作用

[目的]研究重组骆驼蓬脂转移蛋白(recombinant Peganum harmala lipid transfer protein,r Ph LTP)与顺铂(DDP)协同对宫颈癌He La细胞的抑制作用及可能的作用机制。[方法]四甲基偶氮咗蓝(MTT)法检测He La细胞生长的抑制率;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的变化情况。[结果]r Ph LTP与DDP联合应用后与相应的DDP组相比,对细胞生长的抑制率显著增强(P0.01),低浓度r Ph LTP联合2.5μg/m L顺铂对He La细胞的抑制率为(42.50±0.059)%,远高于高浓度顺铂(10μg/m L)对He La细胞的抑制率(36.88±0.134)%,细胞的凋亡率显著增加(P0.01),细胞内ROS极明显升高(P0.001)。[结论]r Ph LTP能够显著增强顺铂对He La细胞的化疗敏感性(P0.001),这种作用可能与r Ph LTP增强顺铂诱导细胞内活性氧的产生导致细胞凋亡有关。     

棉铃虫Hsp70的多克隆抗体制备及鉴定

HSPs(热休克蛋白)是机体在不利环境条件刺激下合成的一类蛋白质,在进化上高度保守,普遍存在于生物体,其中Hsp70是最为保守的成员。研究发现,昆虫滞育过程中普遍存在Hsp70表达上调的现象。然而,现有的研究均是在基因水平的检测结果。为了能从蛋白水平检测棉铃虫中Hsp70的表达,本研究制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。构建了hsp70的原核表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白经镍柱纯化后免疫兔子,制备了棉铃虫Hsp70的多克隆抗体。抗体的效价较高,达到了1∶256 000,此外Western结果表明,制备的抗体能检测出热诱导的Hsp70蛋白。本研究制备了高效价且较为特异的Hsp70对克隆抗体,该抗体为后续从蛋白水平研究棉铃虫滞育过程中Hsp70的表达及其分子机制奠定了基础。     

棉铃虫叉头框蛋白A类似蛋白基因HarmFoxAl的克隆及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并分析一种棉铃虫Helicoverpa armigera叉头框蛋白A (forkhead box protein A, FoxA)类似蛋白基因HarmFoxAl,探讨2-十三烷酮胁迫下棉铃虫中肠中HarmFoxAl的表达情况,为进一步明确棉铃虫FoxA的功能和参与棉铃虫生长发育的调控通路提供依据。【方法】从棉铃虫幼虫中肠中扩增得到HarmFoxAl的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HarmFoxAl的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌Escherichia coli Transetta菌株,IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并利用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白。通过qPCR检测棉铃虫不同发育阶段(1-6龄幼虫和预蛹),6龄幼虫不同组织(脂肪体、中肠、体壁和头部)以及10 mg/g 2-十三烷酮处理6龄幼虫不同时间后中肠中HarmFoxAl的表达谱。【结果】HarmFoxAl(GenBank登录号:XM021331806)的开放阅读框为669 bp,编码222个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为25.03 kD和6.34。氨基酸序列分析表明,HarmFoxAl单体蛋白无信号肽、跨膜区和二硫键,核心区域是由4个α螺旋和3个β折叠组成的球状结构。将重组的Transetta (pET32a-HarmFoxAl)菌株用0.5 mmol/L IPTG在25℃条件下诱导5 h,约45 kD的融合蛋白His-HarmFoxAl能以可溶的形式存在于重组菌中,这与预测的分子量(42.8 kD)相一致。发育阶段特异性表达谱表明,HarmFoxAl在棉铃虫1-3龄幼虫期、6龄幼虫期和预蛹期均有表达,且预蛹期的表达量最高。组织表达谱结果表明,该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠和体壁中表达,且脂肪体内的表达量最高,而在头部中不表达。10 mg/g 2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠中HarmFoxAl的表达量显著降低,但随着时间延长其表达量逐渐升高,处理48 h后表达量显著高于对照。【结论】棉铃虫HarmFoxAl在预蛹期和幼虫脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理幼虫后HarmFoxAl的表达量急速降低后逐渐升高,推测其在棉铃虫变态发育和解毒代谢过程中发挥重要作用。