双价抗真菌基因表达载体的构建及转基因西瓜的研究

构建了同时含有番茄儿丁质酶基因（Chi3）和β-1,3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的双价抗真菌基因植物表达载体,以西瓜（Citrullus lanatus）子叶块为外植体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将Chi3和Glu-Ac同时导入西瓜栽培种“中育一号”,共获得46株抗性再生植株。经PCR、Southern blot和RT—PCR检测,表明外源基因己成功整合到西瓜基因组中,并在转录水平得到表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum）对转基因植株进行离体叶片抗病性检测,表明转基因植株对枯萎病的抗性均有不同程度的增强。     

利用乳酸乳球菌AcmA表面展示b-1, 3-1, 4-葡聚糖酶

采用PCR扩增乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MB191菌株的全长肽聚糖水解酶基因acmA, 通过C-末端融合构建了与绿色荧光基因gfp的融合基因acmA-gfp, 再连接于表达载体pMG36k上后得到可组成型表达AcmA-GFP融合蛋白的重组质粒pMB137, 然后将该质粒电转化导入到乳酸乳球菌AS1.2829中获得重组菌MB137。经SDS-PAGE检测, 重组菌MB137可表达预期的分子量约74 kD的蛋白质。Western blotting、细胞分级分离组分的荧光活性测定和特异GFP二抗标记的流式细胞仪检测证实GFP被成功锚定在重组菌细胞表面, 被锚定蛋白约占总表达融合蛋白的35%。进一步通过从枯草芽胞杆菌BF7658基因组中扩增去信号肽序列的b-1, 3-1, 4葡聚糖酶基因gls, 来取代pMB137中的gfp, 得到携带融合基因acmA-gls的重组质粒pMB138, 经导入到乳酸乳球菌AS1.2829后得到重组菌MB138, 其全细胞b-1, 3-1, 4-葡聚糖水解酶的活性约为12 U/mL菌液, 明显高于对照菌株。     

茶树新梢中纤维素酶活性及相关基因表达差异分析

为了解茶树新梢中纤维素酶的生理特征,对3个茶树(Camellia sinensis)品种新梢中纤维素酶活性的变化和相关基因的表达进行了研究。结果表明,3个茶树品种新梢中的纤维素酶活性差异显著,‘平阳特早’和‘凫早2号’随着叶片成熟度增加,内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性升高,‘舒茶早’则相反。β-葡萄糖苷酶活性在3个茶树品种都是在一芽三叶时期最低,且幼嫩部位的酶活性高于成熟部位,但其酶活性高于外切葡聚糖酶活性。半定量RT-PCR结果表明,5个纤维素酶相关基因在3个茶树品种新梢中均有表达,有2个β-葡萄糖苷酶同源基因的表达量差异显著。因此,纤维素酶可能在茶叶的品质形成中起作用。     

镰刀菌Q7-31T内切葡聚糖酶Egn21的分离纯化及酶学性质

【目的】为进一步研究镰刀菌Q7-31T产生的植物细胞壁降解酶的酶系信息。【方法】以1%(W/V)蛋白胨为氮源,0.5%(W/V)燕麦秸秆为碳源,20°C、120 r/min振荡培养3 d,诱导发酵培养菌株,获得的粗酶液经过Sephacry S-100凝胶柱层析和DEAE琼脂糖弱阴离子交换柱层析,最终得到纯化的内切葡聚糖酶,并对其进行酶学性质分析及串联质谱鉴定。【结果】研究表明:Egn21的分子质量为44.25 kDa,等电点为4.91;酶学特性研究显示:Egn21降解羧甲基纤维素的最适反应温度为40°C,在45°C以下比较稳定。该酶最适pH为6.0,在pH为5.0–8.0条件之间比较稳定。Co~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)对其没有明显作用,而Fe~(2+)、Ca~(2+)、K~(+)、Na~(+)和Mn~(2+)对酶活性有抑制作用,Hg~(2+)会使酶失去活性。【结论】从Q7-31T中分离纯化得到的内切葡聚糖酶Egn21,经过酶学特性与串联质谱鉴定结果显示其属于GH5家族。     

内生枯草芽孢杆菌SWB8 菌株β-1，3-1，4-葡聚糖酶的抗菌作用及细胞毒性

【目的】本文研究从药用植物黄姜中分离的内生枯草芽孢杆菌菌株SWB8分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌活性和细胞毒性。【方法】利用液体发酵、凝胶渗透色谱(GPC)、十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相层析串联质谱(LC-MS/MS)等方法纯化和鉴定枯草芽孢杆菌株SWB8合成的β-1,3-1,4-葡聚糖酶;利用纸片扩散法,检测葡聚糖酶抑制临床致病性细菌和真菌生长的活性;应用MTT法和流式细胞术(FCM)评估此葡聚糖酶对人肺腺癌细胞(A549)和骨髓间质干细胞(MSCs)的细胞毒性。【结果】细菌性β-1,3-1,4-葡聚糖酶显示了广谱的抗菌活性;抗肿瘤活性主要以细胞凋亡的方式选择性的抑制人肺腺癌细胞系A549细胞的增殖,而对人骨髓间质干细胞系MSC细胞无明显影响。【结论】首次报道β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌和抗肿瘤细胞的活性。内生枯草芽孢杆菌SWB8菌株有可能成为抗菌和高效低毒的抗肿瘤药物的潜在来源。     

抗烯醇化酶抗体与（1-3）-β-D-葡聚糖检测诊断侵袭性念珠菌病的临床比较

目的：比较抗烯醇化酶抗体（抗-Eno）检测与（1-3）-β-D-葡聚糖（BG）检测对侵袭性念珠菌病（invasivecandidia-sis,IC）的诊断价值。方法留取临床为诊断IC而送检BG测定的患者血样,用ELISA法测定抗-Eno抗体,以真菌培养结果为基础,分析比较两种血清学方法诊断IC的效能。结果210例患者为研究对象。15例患者经念珠菌培养确诊IC,确诊感染率71%;BG阳性54例,阳性率为257%;抗-Eno阳性33例,检出阳性率为157%。抗-Eno和G试验诊断IC感染的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为467%、867%、212%、955%和333%、749%、93%、936%。两种血清学方法联合检测,敏感性提高至667%。结论抗-Eno对IC的诊断性能优于G试验;联合两种血清学方法,能有效提高敏感性。     

NLRP3敲除小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与分析

目的 采用不同浓度DSS及给药时间诱导NLRP3^-/-小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)模型,并分析与评价其优劣性,为UC发病机制的研究和治疗药物研发提供更贴切临床的动物模型。方法 SPF级48只雄性NLRP3^-/-小鼠随机分组,每组12只小鼠(空白组、2.5%7 d组、3%7 d组和3%5 d组),采用不同浓度DSS和给药时间相结合诱导UC小鼠模型,观察和评价小鼠的体重、DAI评分、HE染色、结肠长度及相关指标(IL-6、TNF-α和紧密连接蛋白(ZO-1))的表达水平评价造模的效果。结果 (1)DSS各小组在不同浓度及给药时间均能诱导UC模型;(2)随着浓度梯度增加及给药时间延长,NLRP3^-/-小鼠的体重减轻越显著、粪便潜血呈阳性越明显、DAI评分越高,甚者出现死亡;(3)经HE染色发现,NLRP3^-/-小鼠肠黏膜屏障组织病理损伤随DSS给药时间增长或浓度增高而加重;(4)采用免疫组织化学方法检测炎症因子及紧密连接蛋白,相对于空白组、模型组的炎症因子(TNF-α及...     

饲料用非淀粉多糖水解酶转基因植物的研究进展

植物来源的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSPs)是单胃动物饲料中的抗营养因子,其中最主要的是β-葡聚糖和木聚糖,这两种多聚糖可被相应的β-葡聚糖酶和木聚糖酶降解而消除其抗营养特性。转基因植物可以表达具有活性的β-葡聚糖酶和木聚糖酶,并正常生长发育。含有非淀粉多糖酶的转基因植物可直接作为饲料原料或饲料添加剂替代目前广泛在饲料中添加的发酵酶制剂。综述了两种非淀粉多糖酶转基因植物的研究进展,并对存在的问题和进一步的发展趋势进行了讨论。     

番茄灰霉病高效拮抗菌株的鉴定及通过导入β-1,3-葡聚糖酶基因提高其生防效果

从淄博市温室土壤中分离到蜡样芽孢杆菌B-04菌株,对灰霉病菌表现较高的拮抗作用。本研究从质粒pUC1940得到4.1kb的β-1,3-葡聚糖酶基因片断,将该基因与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBE2和pHY300PLK连接,获得重组质粒PBE2-glu和pHY300PLK-glu,转入蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B-04菌株,获得工程菌株B-04-glu。限制酶切分析、ABP平板、PCR实验证实B-04成功转入β-1,3-葡聚糖酶基因。与野生菌株相比,平板拮抗试验表明工程菌株较原始菌株对番茄灰霉病（Botrytis cinerea）抑菌效果明显增强。     

米糠多糖的提取纯化及其成分结构和活性分析

研究米糠多糖（ｒｉｃｅ ｂｒａｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ,ＲＢＳ）的提取纯化方法,并对其进行组成成分,化学结构和物理性质分析以及活性测定,热水抽提法从稻糠中制取粗制ＲＢＳ多糖,层析分离纯化得到精制多糖,对精制多糖进行元素分析、糖和蛋白含量测定、红外特征吸收光谱测定和碳谱磁共振测定,以及对Ｂａｌｂ／ｃ小鼠同源Ｍｅｔｈ－Ａ纤维肉瘤抑瘤活性测定等。测定结果显示ＲＢＳ多糖为一种以α－１,４和α－１,