肠道微生物蛋白糖基化修饰的研究进展

肠道微生物在维持人体健康和诱导疾病的发展中扮演着重要角色,其蛋白糖基化修饰深刻影响着宿主的各项生命活动。本文从糖组学的角度出发,讨论并分析了肠道微生物的组成、作用,以及肠道微生物群中代表性细菌的糖基化模式及其密切相关的生理功能,发现及归纳了糖基化对肠道微生物功能和活动的调节方式,为相关疾病的研究及诊治提供了一个新的思路。     

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质

【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。     

早期白假丝酵母血流感染大鼠模型的血浆代谢组学分析

为探寻白假丝酵母(又称白念珠菌)早期感染的血浆代谢标记,采用尾静脉注射白念珠菌方法建立大鼠白念珠菌感染模型。将20只大鼠按随机数字法分为对照组和白念珠菌组,每组10只。应用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography/quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)技术结合数据依赖性采集方式检测大鼠血浆中的代谢物,采用SIMCA-P软件对所测数据分别进行偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)及主成分分析(principal component analysis,PCA),以进行模式识别,区分白念珠菌组与正常对照组血浆代谢物的差异。根据OPLS-DA模型的变量投影重要度(variable importance in the projection,VIP)筛选可能的代谢标记。结果显示,白念珠菌组与对照组的血浆代谢物存在明显差异,OPLS-DA、PLS-DA及PCA模型均可区分两组,初步确认了18个正离子模式鉴定的差异物,对应化合物可能是大鼠念珠菌感染的潜在标记。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析发现,LysoPC(14∶0)、LysoPC(18∶1(9Z))、LysoPC(18∶0)、L-Tryptophan、L-Gulonic acid γ-lactone这5个代谢物ROC的曲线下面积均＞0.90。本研究初步筛选出早期白念珠菌感染的可能代谢生物标记,可为白念珠菌感染早期诊断和治疗提供理论基础。     

构巢曲霉内切纤维素酶A10在毕赤酵母中的表达及重组蛋白质的表征

内切纤维素酶是纤维素酶高效降解纤维素的一个关键因子,已广泛应用于工业生物技术领域。对来源于腐生真菌构巢曲霉的一个内切纤维素酶进行过表达及详细的酶学性质研究,研究结果表明:该内切纤维素酶在摇瓶和发酵罐条件下都成功获得表达,发酵罐条件下的蛋白质表达量达到0.89 mg/mL;该酶的最适反应p H和温度分别为4.0和80℃,在pH 2.0–12.0之间表现出了很好的稳定性;在温度￡60℃时,该酶非常稳定,当温度370℃,酶的稳定性大大降低;Co~(2+)、Mn~(2+)和Fe~(2+)促进了CMCase活性,而Pb~(2+)、Ni~(2+)和Cu~(2+)等金属离子表现出了一定的抑制作用。因此,该构巢曲霉内切纤维素酶表现出了非常好的耐酸、耐碱以及一定的耐热性等性能,具有开发为商品酶的潜力,为深入开发构巢曲霉来源糖苷酶的应用奠定了基础。     

景观规划模式与景观韵律学

景观规划韵律学研究是目前国际景观生态规划的前沿领域。在总结景观规划的“斑－廊－基模式”基础上,将这一模式推广到“斑－廊－网－基－体模式”,并尝试揭示隐藏在这一模式内的景观韵律。景观韵律包括景观要素的形状、结构、层次、组份、形态、配置、连通、辐射、尺度、时序等空间结构和空间过程,景观韵律可以定义为：一定区域内特定时段景观要素的镶嵌格局与空间配置规律。景观度量学的数量分析方法成为景观韵律研究的重要手段和工具。在具体案例分析中,根据研究地区景观要素的空间配置特点、景观韵律的空间变化规律,规划形成3种战略点和四横四纵的景观结构体系。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。     

A蛋白定向固定抗体用于椭偏光学生物传感器免疫检测

椭偏光学生物传感器是在椭偏光学显微成像技术的基础上发展的一项生物传感技术。它能够直接观测固体表面上的生物分子面密度,毋需任何标记辅助,适合发展成为一种无标记免疫检测技术。研究了在硅片表面上通过A蛋白定向固定抗体分子用于椭偏光学生物传感器免疫检测的可能性。实验结果表明,通过A蛋白固定抗体得到的抗体膜层的均一性和固定量的重复性能够保证椭偏光学生物传感器免疫检测结果的质量。通过A蛋白定向固定的抗体的抗原结合位点趋向一致,显著提高了抗体与抗原结合的能力。此外,通过蛋白A固定的免疫球蛋白G分子能够结合更多的多克隆抗体分子说明通过A蛋白固定的蛋白质分子能够较好地保持其空间构象。     

欢迎订阅《菌物学报》

《菌物学报》(曾用名《真菌学报》《菌物系统》,英文刊名Mycosystema)是北大核心、中信所核心、CSCD核心、武大核心(A类)期刊、第四届中国精品科技期刊。报道内容包括菌物多样性、系统分类学、起源与进化、菌物区系地理学、生态学、遗传学、生理学、生物化学、濒危菌物物种保护生物学以及食药用真菌、有毒真菌、真菌毒素、人类病原真菌、植物病原真菌、兽医真菌、互惠共生菌物等方面的研究论文、简报和综述。     

黑曲霉耐酸性α-淀粉酶基因真核表达载体的构建及酶学性质研究

以报道的黑曲霉耐酸性α-淀粉酶基因(ANasamy)为基础设计两条引物,通过PCR等分子生物学手段克隆了一段全长为1975 bp的ANasamy基因,构建了关于ANasamy的表达质粒pPTH-ANasamy,并在黑曲霉菌株中获得表达。分离、纯化重组耐酸性α-淀粉酶并对该酶的基本酶学性质进行研究,该酶蛋白质分子量约为70 kDa,在65℃及pH 4.5条件下催化活力最高,具有较高的热稳定性及低pH耐受性。Cu~(2+)和Fe~(3+)对该淀粉酶活力有较强的抑制作用。     

东亚钳蝎氯毒素通过下调PKM2介导的有氧糖酵解抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性

东亚钳蝎氯离子通道毒素(Buthus martensii Karshch chlorion channel toxin,BmK CT)是一类短链神经毒素,在体内和体外均能有效抑制神经胶质瘤细胞侵袭和增殖。然而,BmK CT抑制胶质瘤细胞增殖活性的机制尚不清楚。本研究采用代谢组学的方法探索BmK CT抑制人脑神经胶质瘤细胞增殖的分子机制。首先,通过蛋白质表达纯化获得带有谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase, GST)标签的BmK CT蛋白和GST蛋白。利用圆二色谱检测两种蛋白质均具有α-螺旋二级结构,并且融合蛋白质GST-BmK CT热稳定性较好。通过噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)法检测GST-BmK CT对神经胶质瘤细胞(U251和A172)增殖的影响。结果显示,与GST处理组相比,1μmol/L GST-BmK CT处理组对U251细胞的抑制率更明显(U251细胞19±1.1 vs. 2.25±0.95,P<0.001, 48 h; A172细胞12±1.4 vs. 2.25±1.25,P<0.001, 48 h)。利用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析鉴定出细胞内的63种代谢物,通过通路分析和聚类分析证实,GST-BmK CT处理影响神经胶质瘤细胞的有氧糖酵解。根据峰面积统计数据显示,GST-BmK CT处理降低胞内丙酮酸的含量。GST-BmK CT处理组相比GST组,明显下调胞外培养基的乳酸分泌(16.33±3.78 vs. 35.6±2.31,P<0.001, 48 h),葡萄糖消耗(2.04±0.09 vs. 2.64±0.04,P<0.05, 48 h)和胞内腺苷三磷酸(ATP)含量(633.79±0.001 vs. 5392.71±266.67,P<0.05, 48 h)。结果表明,GST-BmK CT通过下调胶质瘤细胞有氧糖酵解水平降低ATP的生成。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹结果显示,GST-BmK CT降低U251细胞丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2, PKM2)在转录水平和翻译水平的表达,进一步发现GST-BmK CT通过下调低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)降低PKM2在转录水平的表达。以上结果表明,BmK CT通过下调HIF-1α的表达,降低PKM2介导的有氧糖酵解从而抑制神经胶质瘤细胞的增殖活性。