鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病.本研究根据ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了 3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法.结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360-505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC-B646L、pUC-360-14L和pUC-CD2v的检出限分别为1.572×103拷贝/mL、1.934×103拷贝/mL 和 1.929×103拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2％;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1 215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1 192份样品为阴性,两种方法检测结果一致.本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360-505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义.     

意大利蜜蜂血淋巴HP19蛋白的表达及功能

昆虫血淋巴蛋白HP19主要参与蜕皮激素调控昆虫的变态及发育进程,蜂群内的工蜂、蜂王和雄蜂具有不同的变态和发育历期,为探究hp19在调控意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica三型蜂变态发育中的作用,本研究利用实时荧光定量PCR技术对hp19在不同发育时期的工蜂、雄蜂和蜂王体内的转录水平进行检测。结果表明,该基因在工蜂和雄蜂3龄幼虫体内表达量分别为参照基因的104和105倍,在5龄幼虫体内的表达则分别降为参照的10和102倍,蛹期表达量又都显著提高。hp19在蜂王整个幼虫期的表达保持在参照的102倍,封盖后逐渐上升,至化蛹前达到参照的105倍。在成年工蜂体内的表达为参照的104倍,而在新羽化蜂王和雄蜂体内表达水平为参照的107倍,但在性成熟的产卵蜂王和雄蜂体内的表达显著降低至参照的104倍。hp19在三型蜂体内这种不同的表达模式说明其不仅与三型蜂差异的变态发育历期有关,还可能与雄蜂和蜂王的生殖有关,具有多样的生物学功能。     

HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706的特性分析

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的威胁人类健康的重要传染病,迄今尚无有效的疫苗及特异性抗病毒治疗药物.抗HCV药物的研究和开发面临的关键问题是缺乏合适的HCV感染细胞及动物评价模型.转基因细胞模型是研究人类疾病常用的有效手段,因此,在HCV分子生物学进展的基础上,我们以对HCV翻译与复制有明显调控功能的HCV 5′NCR及部分翻译起始区序列为靶标,构建了HCV 5′NCR及部分多聚蛋白起始区序列与荧光素酶基因的融合基因,插入真核表达载体,转染HepG2细胞,获得了HCV 5′NCR转基因细胞HepG2.9706细胞株[1].本文对该细胞的某些特性进行了分析,以便更好地利用该细胞模型进行药物评价.     

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌, 传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析, 选取相对保守且高度特异的DNA序列, 设计一对特异性引物和一个TaqMan探针, 建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增, 来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明, 对比现有的检测方法, 以ETA基因为靶基因, 基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点, 具有很好的研究价值和应用前景。     

禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立二重荧光定量RT-PCR方法,用于禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的检测。方法：根据AIV和NDV的基因保守序列,设计了AIV和NDV的2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针;对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测AIV和NDV的Z-重荧光定量RT-PCR方法。结果：所建方法特异性好,对AIV和NDV的检测敏感性均达到2000个模板拷贝数,比常规RT-PCR敏感性高100倍;抗干扰能力强,对AIV和NDV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测2种病毒。对保存的AIV或NDV鸡胚尿囊液及临床病料进行二重荧光定量RT-PCR检测,结果尿囊液检测的拷贝数均达到10^10/μL以上,临床病料的拷贝数为2．13x10^8-6．52x10^4／μL。结论：建立了用于检测AIV和NDV的二重荧光定量RT-PCR法,该方法特异、敏感、快速、可定量,对AIV和NDV的防制有重要意义。     

小鼠pαMHC-EGFP胚胎干细胞株的构建

应用电穿孔方法将含有α肌球蛋白重链启动子的pαMHC-EGFP载体转染到D3系小鼠胚胎千细胞,应用200μg／ml新霉素进行药物选择。采用悬浮培养法,体外诱导分化心肌细胞。荧光显微镜下,观察到第7天和第8天拟胚体中出现“跳动”的心肌细胞并同时有绿色荧光蛋白的表达。同时与D3系小鼠胚胎干细胞比较心肌细胞分化率的变化无显著差异（P〉0．05）。该细胞株在分化心肌细胞的同时,具有绿色荧光蛋白的标记,因而利于对心肌细胞的识别和纯化。     

转玉米PEPC基因水稻中有限的C4光合微循环及其生理作用

用转PEPC基因水稻(Oryza sativa L. subsp.japonica Kitaake)和原种水稻Kitaake为材料,研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能.通过测定与光合C4途径有关的关键酶,如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP -苹果酸酶(NADP -ME)、NADP -苹果酸脱氢酶(NADP -MDH)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK),说明原种水稻叶片中具有完整的C4光合酶体系;用外源OAA或MA饲喂叶切片或叶绿体后明显增加光合速率,证明原种水稻中具有一个有限的光合C4微循环.将玉米的PEPC基因导入原种水稻后,可大幅度提高光合C4微循环的速率.测定不同基因型的CO2交换速率,看出水稻中C4光合微循环的增强有提高净光合速率(Pn)和降低光呼吸速率/净光合速率(Pr/Pn)比值的作用.叶绿素荧光特性分析表明,C4光合微循环的增强伴随着PSⅡ电子传递效率(Fv/Fm)和光化学猝灭(qP)的增加以及非光化学猝灭(qN)的降低;这些结果为通过基因工程手段提高作物光合效率的遗传育种提供了科学根据.     

不同pH水平下两种菌根真菌对紫云英生长的影响及其相互作用

设计在不同pH水平（4．3、5．1、5．8、6．8）下两种VA菌根真菌Glomus mosseae和Gigaspora margarita对紫云英Astragalus sinicus进行单接种、混合接种及无接种对照的盆栽实验。对紫云英地上和地下部分生物量、根部侵染率、SDH和ALP酶活进行了检测。实验结果表明：紫云英的生长效应与VA菌根真菌的侵染率及两种酶活成明显相关性。土壤pH升高,单接种Glomus mosseae和混合接种的侵染率也随之升高,而单接种Gigaspora margarita的侵染率呈现出先上升后下降的趋势。本实验设计了特异性扩增Glomus mosseae和Gigaspora margarita的引物gml和gigl,在混合接种实验中,nested PCR扩增结果显示：在低pH水平下（4．3-5．1）大多数根段为Gigaspora margarita所侵染,在高pH水平下（5．8—6．8）Glomus mosseae表现出较强的竞争力,但并没有检测到两种VA真菌存在于同一条侵染根段;对比单接种实验,在低pH水平下,Glomus mosseae显著抑制了Gigaspora margarita的侵染,而在高pH水平下Gigaspora margarita明显促进Glomus mosseae的侵染。     

海水处理对不同产地菊芋幼苗光合作用及叶绿素荧光特性的影响

种植抗盐耐海水经济作物是合理开发利用沿海滩涂和海水资源、培育耐盐植物的有效措施之一。该研究以不同产地菊芋(Helianthus tuberosus)为试验材料研究了海水处理对菊芋幼苗生长、光合作用和叶绿素荧光特性的影响。结果表明:1)随着海水浓度的增加,各地菊芋幼苗根、地上部的鲜重和干重均降低,但盐城菊芋幼苗地上部和根鲜重及干重降低的幅度小于武威和烟台菊芋幼苗。2)随着海水浓度的增加,各地菊芋叶片的净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、水分利用效率(WUE)、气孔导度(G_s)和气孔限制值(L_s)均降低,而细胞间隙CO₂浓度(C_i)增大,且在各处理下盐城菊芋较武威和烟台菊芋叶片P_n和T_r大,而盐城菊芋在15%海水处理下,WUE和C_i较武威及烟台菊芋低,G_s和L_s较武威和烟台菊芋高。3)随着海水浓度的增加,各地菊芋叶片的初始荧光(F_o)、最大荧光(F_m)、可变荧光(F_v)、恒态荧光(F_s)、恒态荧光与初始荧光差值(ΔF_o)、PSⅡ潜在光化学效率(F_v/F_o)和PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)均降低,且在各处理下盐城菊芋较武威和烟台菊芋叶片F_m、F_v、F_s、F_v/F_o大。随着海水浓度的增加,盐城菊芋叶片电子传递速率(ETR)、光化学荧光猝灭系数(q_P)和光化学速率变化幅度不大,武威和烟台菊芋在30%海水处理下显著下降,较盐城菊芋小,各处理下菊芋叶片的PSⅡ实际光化学效率(Φ_PSⅡ)变化也不一致,盐城和武威菊芋叶片的Φ_PSⅡ在15%海水处理较0和30%海水处理下大,而烟台菊芋叶片的Φ_PSⅡ在0海水处理下最大。4)随着海水浓度的增加,各地菊芋叶片的叶绿素a(Chla)含量均降低,而叶绿素b(Chlb)含量没显著差异,且在各处理下盐城菊芋较武威和烟台菊芋叶片Chla含量大,武威和盐城菊芋叶片的Chla/Chlb比值均降低,烟台菊芋叶片的Chla/Chlb比值在0和15%海水处理下没差异。可见海水处理对菊芋幼苗生长发育、光合作用和叶绿素荧光特性均有影响,随海水浓度的增加,其效应越明显,但对各来源地菊芋幼苗的影响不一致,盐城菊芋幼苗表现为更耐海水。     

格氏栲幼苗叶绿素荧光和非结构性碳水化合物积累对种子散布位置的响应

植物种子从母树掉落形成土壤种子库时,凋落物或土壤是其最初接触的物理环境,种子所处位置(种子在凋落物上层、土壤表层或凋落物下层)影响了幼苗天然更新进程。模拟格氏栲种子在凋落物上层(种子下层铺垫2和4 cm凋落物)、土壤表层(无凋落物)及凋落物下层(种子上层覆盖2、4、6和8 cm凋落物)等3种不同散布位置,探讨种子散布位置对幼苗叶绿素荧光特性、非结构性碳水化合物、比叶面积、叶干物质含量和养分含量的影响。结果表明:不同散布位置的幼苗单位面积的叶氮含量与可溶性糖、非结构性碳水化合物含量呈显著正相关,与比叶面积呈显著负相关。适宜凋落物覆盖(2和4 cm)的幼苗通过提高叶绿素相对含量、可溶性糖含量、非结构性碳水化合物含量、叶干物质含量和单位面积的叶氮含量和叶磷含量,降低比叶面积等的资源获取策略来实现自身快速生长需求。无凋落物和深层凋落物覆盖(6和8 cm)的幼苗采取高单位重量的叶氮含量和比叶面积,低叶干物质含量和非结构性碳水化合物含量的资源保守型策略以截获更多有效光资源,进而弥补深层凋落物带来的郁闭环境,降低幼苗因“碳饥饿”而死亡的几率。下层铺垫凋落物的幼苗通过在叶片储藏淀粉,降低叶片光合组织消耗能量(低PSⅡ最大光化学效率)等维持幼苗生长。熵值法综合分析表明,浅层凋落物覆盖(2 cm)对格氏栲幼苗生长的促进作用最为显著,未来可通过调节天然林凋落物层厚度以促进格氏栲幼苗生长与更新。