抗生素抗性基因连锁传播的侧翼保守元件分析

抗生素在医疗、畜牧和水产养殖业的大量使用造成了环境中耐药细菌和抗性基因的日益增加,也加速了抗性基因在环境细菌间的传播扩散.本研究以环境样本直接提取的总DNA为模板,运用热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, Tail-PCR)技术直接扩增抗生素抗性基因上下游序列.通过优化Tail-PCR反应程序,单循环同时扩增出tetW基因的多条侧翼序列,包括6条上游序列和9条下游序列.基于序列的生物信息学分析发现,上游包括一段反向重复序列和已知的一段tetW调节肽序列以及一个已知的插入序列,下游包括一个保守的未知序列和一个开放式阅读框架(the open reading frame,ORF)编码甲基转移酶.结果不仅发现了可能协助tetW基因传播的功能元件,也提供了一个未知侧翼序列高效和便捷的研究方法,即采用Tail-PCR技术,一组样品即能便捷获得多条侧翼序列.     

池蝶蚌Sox2 基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox 基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用, 为研究池蝶蚌中Sox 基因的功能, 以人SRY基因HMG-box 保守区的序列设计简并引物, 以雌、雄池蝶蚌基因组DNA 和精巢cDNA 为模板进行扩增, 获得了2 个不完全相同的序列, 分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2 和cDNA-HMG, 长度均为220 bp, 编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3 及Sox14 有很高的同源性, 雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR 扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2 部分cDNA 片段, 长度为1774 bp, 该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2 的同源性最高; 在部分开放阅读框249 个氨基酸残基中, 具有Sox 家族典型的HMG-box 结构域, 与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2 的HMG-box 同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR 方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8 种组织hs-Sox2的表达情况, 结果显示, hs-Sox2 基因在8 种组织中均有表达, 其中在肾脏中的表达量最高, 其次是肠与闭壳肌, 在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺, 在肝脏中的表达量最低; 为了解hs-Sox2 在不同性腺发育时期的表达情况, 采用实时荧光定量PCR 方法分析了5 个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2 的表达情况, 结果显示在39 月龄性腺的表达量最高, 其次是16 月龄性腺, 63 月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明, hs-Sox2 基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。       

企鹅珍珠贝不同地理群体遗传多样性的fAFLP 分析

为阐明企鹅珍珠贝(Pteria penguin)不同地理种群的遗传多样性机制, 采用荧光标记扩增片段长度多态性(fAFLP)技术分析了企鹅珍珠贝广西涠洲岛、广东流沙湾和海南黎安3 个不同地理群体的遗传多样性。选取7 对引物组合对90 个个体(每个群体30 个)进行fAFLP 扩增, 结果发现每个个体均能扩增出清晰的、可重复的扩增条带, 每对引物的扩增位点数在100—163 之间, 共得到895 个扩增位点, 多态位点数为865 个; 涠洲岛、流沙湾和黎安群体的多态位点比例分别为70.73%、63.13%、66.82%。Nei 遗传多样性指数为0.1634、0.1558、0.1783, Shannon 遗传多样性指数为0.2635、0.2474、0.2932。3 个群体间遗传相似度在0.9722—0.9824之间, 遗传距离在0.0177—0.0282 之间。根据遗传距离绘制UPGMA 聚类图, 但Mantel 检验结果显示企鹅珍珠贝三群体间的遗传距离与地理距离之间无显著相关。Shannon 遗传多样性指数和AMOVA 分析, 结果均显示企鹅珍珠贝的遗传变异主要来源于群体内个体间, 7.91%的遗传变异来自群体间, 92.09%的遗传变异来自群体内。分析群体的显性基因型频率分布和基因流Nm 发现3 个群体有基本相同的遗传结构, 有明显的基因交流。研究结果表明北海涠洲岛群体、湛江流沙湾群体和海南黎安群体的企鹅珍珠贝种质有较高的多态位点比例, 但未发生显著地理分化。这一结果为我国企鹅珍珠贝的良种选育以及种质资源保护措施的制定提供了参考依据。       

冷驯化对异色瓢虫后代生长发育及适合度的影响

为明确冷驯化处理对异色瓢虫Harmonia axyridis后代生长发育及适合度的影响, 本研究通过两性生命表的制作, 在室内条件下调查了冷处理后其后代发育历期、 成虫产卵前期、 寿命和生殖力以及后代生命表参数。结果表明: 冷驯化使异色瓢虫后代卵的发育历期延长, 幼虫（1-4龄）和蛹的发育历期则缩短; 随着冷驯化时间的延长, 后代体长和体重增量均减小。且完成发育的后代成虫产卵前期延长, 寿命缩短, 生殖力下降。后代生命表参数内禀增长率（r）、 周限增长率（λ）、 净生殖率（R₀）和年龄特征存活率（l_x）均降低, 但是后代雌虫所占比例却升高。此外, 冷驯化类型对异色瓢虫后代生长发育的影响也不相同。经相同时间（5 d）的低温诱导, 变温诱导的后代成虫寿命比恒定低温诱导的长, 但是生殖力却低; 变温诱导的后代生命表参数（r, λ和R₀）均小于恒定低温诱导的, 但是l_x却高于恒定低温诱导的。结果说明, 异色瓢虫亲代经历冷驯化, 这种对低温的可塑性反应会延伸到下一代, 而且还能够影响后代的适合度, 这对其在低温下的存活和繁殖具有重要的意义。     

棉铃虫齿唇姬蜂嗅觉受体基因 CchlOrco 的克隆及组织表达谱分析

【目的】昆虫的嗅觉受体（olfactory receptors, ORs）一般以气味分子特异的ORs与共受体（ co-Receptor, Orco）通过形成异质二聚体在嗅觉感受中发挥关键作用,其中Orco由于具有序列的保守性而受到广泛的重视。本研究旨在克隆棉铃虫齿唇姬蜂 Campoletis chlorideae 的Orco基因,并对其组织表达谱进行分析。【方法】利用RT-PCR技术和转录组分析技术克隆棉铃虫齿唇姬蜂的Orco基因,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用Real-time PCR技术对该基因在该蜂成虫不同组织中的表达量进行分析。【结果】获得了棉铃虫齿唇姬蜂 Orco 的全长cDNA序列,命名为 CchlOrco（GenBank登录号：KP255444）。序列分析表明, 该基因开放阅读框全长1 437 bp,编码478个氨基酸,预测该氨基酸序列具有7个跨膜区。CchlOrco 主要在成虫触角中表达,且在雄蜂触角中的表达量最高,是雌蜂触角中表达量的8.0倍,而在其他组织中表达量极低。【结论】本研究克隆了棉铃虫齿唇姬蜂 CchlOrco 序列全长,明确了其在成虫不同组织中的表达水平,为进一步研究该基因及其他嗅觉受体基因功能奠定了基础。     

基于EB1基因的环介导等温扩增（LAMP）法检测感染家蚕微粒子病的蚕卵

【目的】家蚕 Bombyx mori 微粒子病一直影响着蚕种业的健康发展,快速而准确地检测出寄生于蚕卵中的家蚕微孢子虫 Nosema bombycis 对于有效控制家蚕微粒子病危害意义重大。【方法】环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）法是一种快速、灵敏、特异的DNA体外恒温扩增方法,本文基于LAMP检测法的原理,依据家蚕微孢子虫孢子繁殖复制相关的 EB1 基因（GenBank登录号：KF421134.1）设计LAMP引物,对LAMP反应体系的最佳反应温度、内外引物浓度比、检测反应的特异性、灵敏度等进行研究,建立了一种检测蚕卵感染家蚕微粒子病的LAMP检测方法。【结果】结果表明,基于EB1 基因建立的LAMP检测方法在63℃恒温下在1.5 h内就可完成对样品的有效检测,本LAMP法对家蚕微孢子虫孢子DNA的检测灵敏度为5.0×10^-3 ng/μL,对EB1-pMD^TM19-T质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10² copies/μL,同时对人工感染家蚕微粒子病单个母蛾产下蚕卵的1/8卵圈量或1粒蚕卵均能检出阳性结果。上述结果都分别应用凝胶电泳法、恒温荧光检测仪以及SYBR GreenⅠ显色肉眼观察法得到同步判定。【结论】本研究建立的基于EB1基因LAMP法可用于蚕卵微粒子病的检测,LAMP法为蚕种质量检验及成品卵微粒子病现场检疫提供了新技术。     

白屈菜红碱对铜绿微囊藻生长和光合系统的影响

为了阐明白屈菜红碱(Chelerythrine)对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)生长及光合系统的影响, 研究了白屈菜红碱胁迫下铜绿微囊藻M. aeruginosa NIES-843生长、细胞色素含量及叶绿素光诱导荧光动力学变化. 结果显示, 当白屈菜红碱浓度10 g/L时, M. aeruginosa NIES-843的生长受到显著抑制. 通过线性回归分析, 白屈菜红碱对M. aeruginosa NIES-843生长50%抑制浓度(EC50)为(30.621.32) g/L. 当白屈菜红碱浓度为160 g/L时, M. aeruginosa NIES-843单位细胞内叶绿素a (Chl. a)和类胡萝卜素含量均显著低于对照. Chl. a光诱导荧光动力学分析结果显示, 白屈菜红碱胁迫下单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TR0/RC)及单位反应中心捕获的用于电子传递的能量(ET0/RC)均受到显著抑制. 光合系统Ⅱ(PSⅡ)能量分配比率参数分析结果显示, 白屈菜红碱能显著抑制光合系统反应中心电子供体侧电子传递.       

千年笛鲷早期发育及视蛋白基因表达规律分析

初步观察千年笛鲷早期发育各个时期的形态特征, 同时使用实时荧光定量PCR方法对4种视蛋白基因在早期发育中的表达规律进行分析。研究观察到千年笛鲷卵为圆球形, 属浮性卵, 中心有一明显的油球。在水温(24.50.5)℃的条件下, 千年笛鲷胚胎发育共经历6个发育阶段18个时期, 从受精卵到孵化一共经历24h。仔鱼经历1215d发育为稚鱼, 30d35d发育为幼鱼。同时对7个胚胎发育时期和2个仔鱼发育时期4种视蛋白(LWS、SWS1、SWS2、RH)基因的表达情况进行检测, 在下包1/2、胚孔封闭、视囊这3个时期有显著性表达(P0.05), 尤其在胚孔封闭时期, 表达量达到最高。其余时期4种基因的表达水平显著下降, 但在2个仔鱼时期表达量比孵化期略有增加。结果表明千年笛鲷4种视蛋白基因在早期表达过程中与神经胚的形成有密切的联系。       

活细胞结构力学与荧光张力检测探针

微观力学效应决定着细胞形态结构变化,胞内动力蛋白、肌球蛋白和驱动蛋白等马达分子,构成了细胞微丝微管骨架结构组装的原始驱动力.而以细胞骨架结构为支架的力学感受器,也反馈性调节着细胞力学信号及其生物学效应,组成细胞结构调控必不可缺的力学基础,两者协同调控了机体生理和病理活动.本文从生物微观力学效应和信号入手,介绍了一种基于荧光共振能量转移(FRET)原理的活细胞结构力学检测新技术,将微观结构力学变化转换为光学信号,并采用克隆技术将其插入α辅肌动蛋白、β肌动蛋白及血影蛋白等骨架及相关蛋白质,观察活细胞、组织甚至动物整体水平结构力学变化,为癌细胞侵袭转移、分裂增殖、细胞极化、反分化以及太空失重等生物物理医学研究探寻新的途径.     

荧光双分子互补分析Ezrin与L-periaxin的互作模式

腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病. Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用.在前期已证实L-periaxin与Ezrin间存在蛋白互作的基础上,本文通过分子荧光互补实验,结合免疫荧光定位实验、免疫共沉淀等技术,进一步分析并揭示了L-periaxin蛋白与Ezrin蛋白之间的互作方式,具体为L-periaxin(1 200 aa)与Ezrin(1 296 aa)以及L-periaxin (1 060～1 461 aa)与Ezrin(475～585 aa)以“头对头”与“尾对尾”的方式发生相互作用.Ezrin可能是一种引导L-periaxin在施万细胞膜上堆积的新的分子配体,二者可能通过蛋白分子间更加紧密的方式完成在细胞膜处的堆积,参与到髓鞘的维护中.