实时荧光PCR结合融解曲线分析快速鉴定临床常见曲霉菌

目的 采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法快速将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平.方法 ①普通PCR扩增真菌ITS区后进行序列比对,准确鉴定菌种并设计种特异性引物和探针.②采用实时荧光PCR的方法及融解曲线分析,根据不同的解链温度将5种临床常见曲霉菌鉴定到种的水平.③特异性、敏感性、重复性试验.结果 ①解链曲线分析显示,不同种曲霉菌的种特异性探针有特异的Tm值,根据Tm值的不同可以将5种曲霉菌区分开来:烟曲霉Tm =61.4℃,黄曲霉Tm=57.4℃,黑曲霉Tm=67.7℃,土曲霉Tm=55.2℃和64.5℃,构巢曲霉Tm=65.8℃.其中小孢根霉和疣状瓶霉与烟曲霉探针发生交叉反应,阴性对照不出现特异性的解链曲线.②该方法对5种曲霉菌的检测下限分别为:烟曲霉56.8 fg,黄曲霉1 110fg,黑曲霉13.7 fg,土曲霉123 fg,构巢曲霉780 fg.③重复性试验结果显示,同一种曲霉菌的Tm值波动范围不超过0.5℃.结论 采用实时荧光PCR结合融解曲线分析的方法可以快速准确地将临床常见曲霉菌鉴定到种的水平,具有良好的敏感性、特异性和可重复性,有助于临床侵袭性曲霉感染的诊断和指导抗真菌药物使用.     

色氨酸残基在内切葡聚糖酶分子中的作用

内切葡聚糖酶的化学修饰研究表明：色氨酸残基可能位于活性位点,与底物结合有关．荧光光谱测定指出该酶的荧光几乎都来自色氨酸残基,酶分子中色氨酸微环境对ｐＨ变化非常敏感,降低ｐＨ导致了酶分子构象发生了较大变化,配基结合使酶分子色氨酸微环境产生了改变,引发了与ｐＨ诱导不同的构象变化．     

里氏木霉绿色荧光蛋白表达载体的构建及功能鉴定

为了后续研究里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因的表达与调控,利用overlap PCR及分子克隆技术构建了含有Col E1原核复制起始位点、氨苄青霉素抗性、里氏木霉的丙酮酸脱羧酶启动子、丙酮酸脱羧酶终止子、潮霉素B抗性的筛选标记并能表达增强型绿色荧光蛋白(Zs Green)的表达载体p LXT-Zs Green。将该载体转化里氏木霉QM9414原生质细胞,使用潮霉素B筛选平板得到阳性转化子,随后使用荧光显微镜在488 nm激发光下观察菌丝,并随机挑取4个转化菌株进行Western-blot验证。结果显示,里氏木霉菌丝体可发出明亮的绿色荧光,而且Western-blot验证了该载体能够在里氏木霉中有效地表达增强型绿色荧光蛋白。上述研究表明,载体p LXT-Zs Green在里氏木霉中能够稳定高效地表达外源基因,为研究里氏木霉的基因表达调控奠定了实验基础。     

啮齿类动物中汉坦病毒感染血清学和病原学检测方法比较研究

致病性汉坦病毒的宿主主要为啮齿类动物,其病毒感染状况是人间疫情发生的关键影响因素,可通过检测宿主动物标本中病毒基因组RNA、蛋白抗原及特异性抗体而进行监测。本研究利用367份鼠肺及鼠血标本,对双抗原夹心ELISA(ELISA)、实时荧光RT-PCR(RT-PCR)和免疫荧光(IFA)等三种分别检测抗体、核酸和抗原的方法进行比较评估。ELISA法检出抗体阳性鼠血标本46份,阳性率为12.53%;RT-PCR法检出病毒RNA阳性鼠肺标本28份,阳性率为7.63%;IFA检出抗原阳性鼠肺标本24份,阳性率为6.54%。宿主动物组织标本中检出汉坦病毒RNA和(或)结构蛋白抗原的标本,对应的血液标本中可检出病毒特异性抗体,100%(24/24)IFA检测阳性标本和89.3%(25/28)RT-PCR检测阳性标本对应血标本ELISA抗体检测阳性,反之亦然,检出抗体的标本基本包含了可检出抗原和RNA的标本。RT-PCR与IFA检测结果差异无显著性(χa2=0.64,P0.05),一致性检验Kappa系数为0.71,一致性高(Z=13.66,P0.05),首先对血标本开展基于ELISA的特异性抗体检测,可显著缩小RT-PCR或IFA法检测病毒RNA或抗原的范围(χb2=12.04,χc2=20.05,P0.05)。本研究为宿主动物汉坦病毒感染实验室监测方案优化提供了有益的依据。     

一个适用于分离光系统Ⅱ的凝胶电泳系统

用一高分辨率的凝胶电泳系统从延长破碎时间的蓝藻类囊体膜增溶物中分离出１４条绿色的带。按照电泳迁移率的增加顺序,自上而下分别是ＣＰＩａ,ＣＰＩｂ,ＣＰＩｃ,ＣＰＩｄ,ＣＰＩｅ,ＣＰＩｆ,ＣＰＩｇ,ＣＰＩｈ,ＣＰａ１,ＣＰａ２,ＣＰａ３,ＣＰａ４,ＣＰａ５和ＦＣ。ＣＰａ１,ＣＰａ２,ＣＰａ３,ＣＰａ４和ＣＰａ５５种叶绿素蛋白复合体的吸收光谱相似,它们在蓝区的吸收峰位子４３６ｎｍ,而红区的吸收峰则位于６７０—６７３ｎｍ附近。它们的低温荧光发射光谱亦很相似,其荧光发射峰都位于６８５ｎｍ处。因此它们都属于光系统Ⅱ叶绿素ａ蛋白复合体．跟传统电泳相比,该系统对光系统Ⅱ的分离能力提高了１．５倍。     

利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究

转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键．利用高通量、快速、灵敏的SYBR Green Ⅰ荧光定量实时PCR法,检测了转大麦烟酰胺合成酶基因（NASl）水稻中外源基因拷贝数．以蔗糖磷酸合成酶基因（SPS）作为水稻的内源参照基因．通过梯度稀释法．分别获得了NAS1和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线,相关系数分别为0．99976和0．99571,相关性高．通过目的基因NAS1和水稻内源参照基因SPS起始模板数的比较,获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数。在8株转基因株系中,1株为假阳性,1株拷贝数为1,3株拷贝数为2,其余3株拷贝数分别为3、4和7．而阴性对照拷贝数为0．这种方法快速、简便、准确,可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择．     

新型数字化高灵敏度荧光显微镜及其在生物学中的应用

尽管普通荧光显微镜已广泛应用于生物医学领域,其性能上还存在一些不足,为了克服它的弱点,借助于像增强器和ＣＣＤ,将倒置生物显微镜改造为数字化高灵敏度荧光显微镜,并增加动态图像获取功能。改进后的荧光显微镜具有以下优点：（１）灵敏度极高,可探测微弱的荧光图像;（２）运用图像融合技术,实现荧光准确定位;（３）适合于观察切片和活细胞;（４）可研究细胞荧光图像的动力学特征;（５）能够给出图像上各点的坐标和对应的发光强度,具有定量显示特点;（６）图像处理软件功能完善,操作方便。利用该荧光显微镜,以吖啶橙为荧光标记物观察正常细胞和凋亡细胞的不同状态,获得良好的实验效果。     

两种抗生素对酸性磷酸酶部分理化性质的影响

研究两种抗生素间甲氧嘧啶和蒽诺沙星对酸性磷酸酶活性的影响,发现两种抗生素都对酶有抑制作用。利用双倒数作图法表明两种抗生素对酶的抑制作用为非竞争抑制,Dixon作图法求得Ki值分别为0.35和0.4 mmol/L。采用紫外差光谱和荧光光谱研究甲氧嘧啶和蒽诺沙星与酸性磷酸酶的相互作用,结果显示间甲氧嘧啶和蒽诺沙星使酶的紫外吸收增强,荧光强度减弱,其中蒽诺沙星使酶的荧光光谱产生红移。说明这两种抗生素对酶的构象有不同程度的影响。     

多光子显微镜在研究阿尔茨海默病中的应用

多光子显微镜采用近红外线激发荧光成像,能直接观察AD老年斑的自然病理进展,并且在鼠模型中进行抗老年斑治疗的疗效评估.其高分辨率的特点,可用于监测蛋白与蛋白之间、蛋白构象改变和蛋白水解而产生的荧光共振能量转移(FRET)改变.     

家蝇飞翔肌线粒体超氧化物歧化酶活性及荧光衰老色素含量的年龄变化的研究

超氧阴离子(O_2~-)是生物体内的主要自由基。自由基与很多大分子如脂质、蛋白质及核酸等反应,破坏细胞的结构,干扰细胞的功能,根据Harman 的自由基理论,最终导致有机体的衰老和死亡。超氧化物歧化酶(SOD)促进O_2~-的歧化反应,对机体起保护作用,因此认为它与寿命有关。荧光哀老色素(FAP)又叫脂褐素,被认为是自由基诱导的不饱和脂肪酸和其他大分子如:蛋白质、核酸等氧化的终产物。它的含量被看成是发