草鱼干扰素的体外诱生及其组织细胞的来源

草鱼九种组织干扰素（IFN）体外诱生试验结果表明,从头痛、脾脏、外周血和胸腺组织中均能诱生出IFN。进一步对四种组织的细胞组分进行分离和IFN诱导,证实IFN由其中的白细胞所合成。理化性质、中和试验、Dot-ELISA和Western-blot等研究表明,体外诱生的白细胞IFN与体内诱生的血清IFN是同一种物质。在此基础上,进而采用灭活增殖细胞法,对T、B淋巴细胞进行了功能性分离和IFN诱导,初步证实了T淋巴细胞是草鱼产生IFN的主要白细胞。     

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用

旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。     

草鱼肾细胞电转条件的优化及草鱼呼肠孤病毒NS26蛋白的瞬时表达

本研究先以pEGFP-N1载体质粒中的绿色荧光蛋白基因为报道基因进行电转实验,优化电压、脉冲时间、质粒添加量和电击次数等电转条件,确立最佳条件。实验表明,细胞密度为1.5×107/mL时,取200μl在0.2cm电击杯中进行电击转染,电压为200V,脉冲时间为45ms,添加质粒30μg,电击1次时,转染效果最佳。提取草鱼呼肠孤病毒基因组总RNA,以其逆转录的cDNA作为扩增模板,设计特异引物扩增出GCRV非结构蛋白NS26的基因片段,重组到pEGFP-N1载体上得到重组质粒pEGFP-NS26,将其导入CIK细胞中用电转法高效表达了EGFPNS26融合蛋白。本研究为进一步研究NS26的功能奠定了基础。     

草鱼肠道酸碱度的研究

胃肠道是一个复杂的消化系统, 每一部分都具有独特的生理特征。酸碱度(pH)是消化道重要的生理指标之一, 其对营养物质的消化、吸收和肠道微生物的生长等具有重要影响。为了研究草鱼在食物消化过程中, 肠道的酸碱度变化, 测定了草鱼肠道食物糜、肠液和黏膜的pH。结果显示, 随着食物的消化, 它们的pH都有下降的趋势。肠道食物糜pH在6.86±0.24到8.43±0.10之间, 肠液pH在7.14±0.22到8.63±0.02之间, 相同时间点相同肠段两者之间的pH差异很小, 并且在实验期间两者的pH变化趋势相同。黏膜pH在6.23±0.04到6.7±0.13之间, 为弱酸性。除了时间点12h外, 相同时间点和相同肠道部位黏膜的pH与食物糜、肠液的pH相比均有显著性差异(P<0.05)。分析发现草鱼摄食食物的pH与上述三相的pH之间均有显著性差异(P<0.05), 研究结果为草鱼消化生理及营养学研究提供了基础资料。     

益生芽孢杆菌对草鱼肠黏膜结构的保护作用

为了研究益生菌对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道黏膜结构的保护作用, 选取健康草鱼随机分成3组: ①对照组: 口灌无菌PBS 0.2 mL/尾后第2和第4天分别口灌无菌PBS 0.1 mL/尾; ②嗜水气单胞菌组(Ah组): 口灌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)菌液0.2 mL/尾(1.0×107 cfu/mL)后第2和第4天分别口灌无菌PBS 0.1 mL/尾; ③枯草芽孢杆菌保护组(Ah+Bs组): 口灌嗜水气单胞菌菌液0.2 mL/尾后第2和第4天分别口灌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌液0.1 mL/尾(1.0×107 cfu/mL); 连续7d取中肠中部, 通过检测草鱼肠黏膜形态及肠上皮细胞微丝骨架的变化, 旨在研究益生枯草芽孢杆菌对嗜水气单胞菌造成的肠黏膜结构损伤的保护作用。结果表明: Ah组病变主要表现为肠道黏膜上皮细胞变性, 坏死, 大量脱落; 固有层出血、水肿变粗; 大量炎性细胞浸润; 超微结构变化表现为紧密连接缝隙明显变宽; 微绒毛萎缩变短, 稀疏, 排列紊乱; 线粒体可见明显肿胀、嵴减少, 内质网明显扩张; 肠上皮细胞中的微丝呈绿色雾状, 微丝荧光强度逐渐减弱, 明显低于对照组。与Ah组相比, Ah+Bs组上述病变有明显改善, 肠道黏膜上皮细胞轻微脱落, 炎症和出血等症状明显减轻; 紧密连接缝隙明显变窄; 微绒毛数量多且排列较整齐; 线粒体无明显肿胀; 肠上皮细胞中的微丝荧光强度高于Ah组。结果说明益生芽孢杆菌对嗜水气单胞菌造成的肠黏膜结构损伤有一定的保护作用。     

摄食声对草鱼幼鱼的诱集作用

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼为实验对象,进行了声音播放实验,旨在探究草鱼幼鱼对水下录制的草鱼摄食浮萍声音(简称摄食声)的行为反应。以不播放声音的草鱼鱼群作为对照,探讨了4种单频音(500、1000、2000和3000 Hz)和摄食声对草鱼游泳行为和在水槽内的分布的影响。结果表明:在播放单频音时, 3min内草鱼的趋音游泳速度和逗留时间与对照组无显著性差异(P>0.05);在播放摄食声时, 3min内草鱼的趋音游泳速度和逗留时间显著高于4种单频音组和对照组(P<0.05);在播放单频音时, 20min内草鱼的平均游泳速度、水槽内的分布和趋音率与对照组无显著性差异(P>0.05);在播放摄食声时, 20min内草鱼的平均游泳速度和趋音率都显著高于4种单频音组和对照组(P<0.05)。草鱼摄食声对草鱼幼鱼有诱集作用,为声音诱鱼技术研究提供了科学依据。     

人工养殖云斑尖塘鳢的生长特性

研究了人工养殖条件下云斑尖塘鳢（Oxyeleotris marmoratus）的生长特性。结果表明：经过2个月的生长期,云斑尖塘鳢的平均体长从最初的（17．36&#177;0．99）cm增加到（19．05&#177;0．57）cm,体质量从（139．13&#177;12．90）g增加到（205．50&#177;15．78）g,体长增加10％,体质量增加48％。不同的养殖时间除对摄食率（FR）无显著影响外（P〉0．05）,对特定生长率（SGR）、饵料转化效率（FCR）和生长效率（GE）都有显著影响（P〈0．05）。体长生长与时间表现为线性相关,体质量生长与时间表现为指数相关。云斑尖塘鳢体质量与体长之间呈幂函数关系,不同养殖时间下,幂指数b值都接近3,表明云斑尖塘鳢的体长和体质量呈等速生长。     

摄食不同饵料草鱼肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱构建及分子鉴定

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术(DGGE)对摄食不同饵料(非膨化饲料组、膨化饲料组和蚕豆组)的草鱼肠道内容物细菌分析建立指纹图谱,并对主要优势条带进行了切胶克隆和测序。PCR-DGGE指纹图谱初步分析发现,非膨化饲料组、膨化饲料组和蚕豆组分别产生了19条、16条和15条可以鉴别的条带,且均有2-3条优势菌条带;非膨化饲料组样品和蚕豆组样品的DGGE指纹图谱的相似性系数为53.6%,非膨化饲料组菌群和膨化饲料组的相似性为39.4%。对PCR-DGGE指纹图谱主要条带进一步回收、克隆和测序,结果共得到25条序列,将所得到的序列在NCBI数据库中同源性分析,发现草鱼肠道内容物细菌群落主要为弧菌科、肠杆菌科和气单胞菌属细菌,其中包括14条不可培养细菌。     

水生动物和大鼠线粒体的呼吸链比较

用陆生哺乳动物线粒体呼吸链与水生动物线粒体呼吸链相比较的研究方法,探讨了呼吸链的功能与环境相适应的关系。研究了淡水中生活的草鱼肝丝线粒体,观察到琥珀酸脱氢酶的活性非常低,而ＮＡＤＨ脱氢酶和泛醌细胞色素Ｃ还原酶的活性较高。但海洋生物海绵的线粒体ＮＡＤＨ脱氢酶和琥垢酸脱氢酶的活性都非常低。     

从随机噬菌体肽库中筛选抗草鱼出血病病毒多肽的研究

从随机噬菌体九肽表位库中筛选出抑制草鱼出血病病毒（ＧｒａｓＣａｒｐＨｅｍｏｒｈａｇｅＶｉｒｕｓ,ＧＣＨＶ８７３）感染的多肽分子。采用完整、生物素化的草鱼出血病病毒颗粒作为受体,与以融合蛋白形式在丝状噬菌体ｆＵＳＥ５的外壳蛋白Ⅲ的Ｎ端表达的随机九肽库作用。经三轮体外亲和筛选（Ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）及ＥＬＩＳＡ法检测后,从肽库中筛选出１６个与病毒高亲和力结合的噬菌体克隆,其中六个阳性克隆能有效地抑制病毒在ＣＩＫ细胞中的复制,并使病毒的半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤ５０）下降五个数量级。表明噬菌体肽库技术完全能够应用于抗病毒研究,为研制抗病毒短肽制剂打基础。