东江草鱼标志放流技术研究

东江放流草鱼的全长为(18.2±2.0)cm,体长为(14.8±1.6)cm。在标记前进行草鱼食性转化驯养。试验采用两种标志方法对草鱼进行标记,第一种方法用直径为0.14 mm的铜丝把椭圆形塑料标志牌(8mm×5mm×1mm)挂在草鱼背鳍第一和第二支鳍骨间缝隙处,第二种方法剪除左侧腹鳍。标记后需进行为期10 d的暂养,使其穿刺部位愈合。总共放流草鱼10万尾,其中标志草鱼4万尾(挂牌标记1万尾,切腹鳍标记3万尾),标志草鱼占放流草鱼总数的40%,放流后1个多月时间内,总共回捕放流草鱼881尾,其中标志草鱼278尾,标志草鱼占回捕放流草鱼总数的百分率(标志率)为31.6%,总回捕率为0.695%。同时,食性分析发现放流草鱼已摄食江中水草和水葫芦的根,并带进一些藻类,饱食度高(4～5级),表明其在1个多月时间内完全适应了江中环境,放流效果好,标志放流技术可行。该技术要点:(1)放流草鱼的体长在11～17 cm范围内,既适于作切腹鳍标志,又适合作挂牌标记,其挂牌位置为背鳍肌肉内第一与第二支鳍骨间缝隙:(2)标记后需要经过约10 d的暂养治疗使伤口愈合;(3)放流前应作2周的食性转化训练,从吃饲料转变为吃草;(4)在水草茂盛的江段放流有利于放流草鱼尽快找到食物,较快适应环境,提高成活率。     

草鱼cyclin G1基因的克隆、鉴定及适应性进化分析

本研究从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝肾cDNA文库中克隆到草鱼cyclin G1基因.测序结果表明,草鱼cyclin G1全长cDNA为2 118 bp,使用ORF finder推译其开放阅读框为第256 bp～第1 155 bp,编码299个aa,SMART在线软件预测其中N端第57个aa～第143个aa为细胞周期蛋白盒.同源性比对分析显示cyclin G1在鱼类中同源性极高,其中草鱼cyclin G1与斑马鱼的同源性为90%.通过PAML软件的密码子替换模型进行适应性进化分析,结果表明cyclin G1编码蛋白的26A、171A和225K氨基酸位点受到正选择作用.本研究为进一步了解草鱼cyclin G1结构功能与分子演化打下基础.     

饥饿对草鱼非特异免疫水平的影响

研究了长期饥饿对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)非特异性免疫水平的影响。实验选取平均体质量(31.86±1.47)g的草鱼,随机分为2个实验组(对照组和饥饿组),每组3个平行,饥饿处理15、30、45和60 d,测定饥饿对草鱼头肾和脾中自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性、血清和肝胰脏中溶菌酶活性、血清中碱性磷酸酶活性的影响。结果表明:受饥饿胁迫的影响,草鱼自然杀伤性细胞在脾和头肾中的杀伤活性显著低于对照组(P0.05)且不随着饥饿时间的延长发生显著性变化;随着饥饿时间的延长,血清和肝胰脏中溶菌酶呈现先升高后降低的趋势,血清碱性磷酸酶在饥饿15、45、60 d时显著低于对照组;饥饿组的碱性磷酸酶活性在饥饿30 d以后,维持恒定。由此可见,长时间的饥饿胁迫降低了草鱼的免疫水平。相比较而言,自然杀伤细胞的杀伤活性在反映鱼类免疫状况时比溶菌酶和碱性磷酸酶可能更为灵敏。     

饥饿胁迫对草鱼鱼种非特异免疫力的影响

研究长期饥饿对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼种非特异性免疫力的影响。实验选取平均体质量(31.86?1.47g)的草鱼,随机分为2个实验组(对照组和饥饿组),每组三个平行,饥饿处理15、30、45和60d,测定饥饿对头肾和脾脏中自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性、血清和肝胰脏中溶菌酶活性、血清中碱性磷酸酶活性的影响。结果表明：受饥饿胁迫的影响,草鱼鱼种自然杀伤性细胞在脾脏和头肾中的杀伤活性显著低于对照组(P<0.05)且不随着饥饿时间的延长发生显著性变化;随着饥饿时间的延长,血清和肝胰脏中溶菌酶呈现先升高后降低的趋势,血清碱性磷酸酶在饥饿15d、45d、60d时显著低于对照组;,饥饿组的碱性磷酸酶活性在饥饿30d以后,维持恒定。由此可见,长时间的饥饿胁迫降低了草鱼鱼种的免疫力。相比较而言,自然杀伤细胞的杀伤活性在评价鱼类的免疫状况时比溶菌酶和碱性磷酸酶更为灵敏。     

摄食不同饵料草鱼肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱构建及分子鉴定

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术(DGGE)对摄食不同饵料(非膨化饲料组、膨化饲料组和蚕豆组)的草鱼肠道内容物细菌分析建立指纹图谱,并对主要优势条带进行了切胶克隆和测序。PCR-DGGE指纹图谱初步分析发现,非膨化饲料组、膨化饲料组和蚕豆组分别产生了19条、16条和15条可以鉴别的条带,且均有2-3条优势菌条带;非膨化饲料组样品和蚕豆组样品的DGGE指纹图谱的相似性系数为53.6%,非膨化饲料组菌群和膨化饲料组的相似性为39.4%。对PCR-DGGE指纹图谱主要条带进一步回收、克隆和测序,结果共得到25条序列,将所得到的序列在NCBI数据库中同源性分析,发现草鱼肠道内容物细菌群落主要为弧菌科、肠杆菌科和气单胞菌属细菌,其中包括14条不可培养细菌。     

草鱼肝细胞的分离与原代培养

目的以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝细胞为实验对象,在不同条件下进行原代培养,以探讨适合草鱼肝细胞生长的最佳条件及培养方法,用于饲料营养与非营养物质对草鱼肝细胞代谢、损伤作用机制的研究。方法采用温胰蛋白酶消化法和红细胞裂解液分离、纯化肝细胞,MTT法测定细胞增殖率,并测定不同时期培养液上清液中LDH、Alb和BUN的含量,分析肝细胞生长状况。结果采用0.25%浓度的温胰蛋白酶消化法,消化20min,分步收集肝细胞,经台盼蓝染色检测和血球计数板计数,活细胞数≥99%。结论在含10%胎牛血清、10μg/mL胰岛素的M199培养基中,以接种浓度1.7×106cell/mL左右为宜,置于27℃、4.5%CO2浓度的恒温培养箱中,可成功培养草鱼原代肝细胞。     

云斑尖塘鳢AFLP分析技术的建立

以云斑尖塘鳢为对象,对其扩增片段长度多态性（AFLP）体系中的连接、预扩增、选择扩增等关键步骤的参数进行了对比实验。结果表明,在采用磷酸化接头,预扩增PCR增加延伸反应及20倍稀释预扩增产物的条件下,可得到清晰稳定的电泳图谱。所筛选的48个引物组合中,14个引物组合的产物带型稳定清晰,分布均匀,扩增片段为50-70条。本研究获得的AFLP优化参数及引物能够运用于云斑尖塘鳢群体遗传分析及分子辅助育种研究。     

饲料氧化鱼油引起草鱼肠道结构损伤、通透性增加

为了探讨饲料氧化鱼油对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道组织结构及其通透性的影响, 本实验以豆油、鱼油及氧化鱼油作为饲料脂肪源, 分别设计鱼油组(6F)、豆油组(6S)、2%氧化鱼油(4S2OF)、4%氧化鱼油(2S4OF)及6%氧化鱼油(6OF) 5组等氮、等能的半纯化饲料。经72d池塘网箱养殖后, 实验结果显示: (1)氧化鱼油显著增加(P0.05)草鱼血清和肠道MDA含量、增加肠道GSH含量(P0.05), 但随氧化产物含量上升GSH含量出现下降。(2)氧化鱼油会显著降低肠道内胆汁酸的含量(P0.05)。(3)氧化鱼油会显著增加肠道绒毛中杯状细胞的数量(P0.05), 且随着氧化产物的增加, 肠道微绒毛高度呈现先上升后下降趋势。(4)氧化鱼油会导致肠道紧密连接间隙增大, 增加肠道通透性, 使血清中D-乳酸及内毒素含量显著增加(P0.05)。结果表明, 饲料中鱼油氧化产物损伤了草鱼肠道组织结构, 尤其是肠道上皮细胞紧密连接结构损伤严重, 从而破坏了肠道黏膜的机械屏障功能, 使肠道通透性显著增加, 肠道细菌内毒素等发生转移。鱼油氧化产物会引起草鱼肠道氧化与抗氧化应激反应, 干扰草鱼肝-肠正常胆汁酸循环, 致使草鱼肠道胆汁酸不足。     

草鱼在摄食高能饲料后血清生化指标的动态变化

为研究草鱼(Ctenopharyngodon idella) 在摄食高能饲料后血清生化指标的动态变化, 选择均重为(55.0±2.5) g 的健康草鱼320 尾, 随机分成4 组, 每组4个重复, 分别以3组高能纯化饲料(分别以额外的蛋白质、脂肪、糊精供能, 高能饲料组较对照组总能量提高11%)及对照组饲料喂养草鱼11周后, 将鱼体禁食48h后采样(对照), 再饱食投喂, 在摄食后的2h、8h和24h取样, 测定实验鱼8种血清生化指标, 并对采样时间点(T)和不同饲料(D)进行双因素方差分析。为确保实验结果的准确性, 需要保证不同处理组的采样时间同步性, 即均在餐后同一时间点采样。结果显示: 除血清总胆固醇(TCHO)含量外, 血清碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性, 以及血清甘油三酯(TAG)、葡萄糖(GLU)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)含量均受到采样时间点(T)即餐后时间的显著影响, 饲料(D)对上述8个指标亦均有显著影响, 且两者存在交互作用。草鱼血清GLU含量和血清AST活性均在餐后2h达到峰值, 血清ALT和ALP活性以及LDLC含量均在餐后24h达到峰值, 血清TAG含量在餐后8h达到峰值, 而血清TCHO和HDLC含量则无明显峰值。在餐后24h, 3个高能组的ALT活性和GLU含量较对照组显著升高, 血清AST和ALP活性以及TAG、TCHO和HDLC含量较对照组无显著差异。上述结果表明, 草鱼血清生化指标受到餐后采样时间点和饲料的显著影响。     

Construction and Co-expression of Grass Carp Reovirus VP6 Protein and Enhanced Green Fluorescence Protein in the Insect Cells

Grass carp reovirus(GCRV),a disaster agent to aquatic animals,belongs to Genus Aquareovirus of family Reoviridea.Sequence analysis revealed GCRV genome segment 8(s8) was 1 296 bp nucleotides in length encoding an inner capsid protein VP6 of about 43kDa.To obtain in vitro non-fusion expression of a GCRV VP6 protein containing a molecular of fluorescence reporter,the recombinant baculovirus,which contained the GCRVs8 and eGFP(enhanced green fluorescence protein) genes,was constructed by using the Bac-to-Bac insect expression system.In this study,the whole GCRVs8 and eGFP genes,amplified by PCR,were constructed into a pFastBacDual vector under polyhedron(PH) and p10 promoters,respectively.The constructed dual recombinant plasmid(pFbDGCRVs8/eGFP) was transformed into DH10Bac cells to obtain recombinant Bacmid(AcGCRVs8/eGFP) by transposition.Finally,the recombinant bacluovirus(vAcGCRVs8/eGFP) was obtained from transfected Sf9 insect cells.The green fluorescence that was expressed by transfected Sf9 cells was initially observed 3 days post transfection,and gradually enhanced and extended around 5 days culture in P1(Passage1) stock.The stable high level expression of recombinant protein was observed in P2 and subsequent passage budding virus(BV) stock.Additionally,PCR amplification from P1 and amplified P2 BV stock further confirmed the validity of the dual-recombinant baculovirus.Our results provide a foundation for expression and assembly of the GCRV structural protein in vitro.