苦荞黄烷酮3-羟化酶基因F3H的克隆及序列分析

为提高黄酮代谢途径中的关键酶活性,增加苦荞黄酮类化合物的合成量,根据已知植物的F3H基因同源序列,采用RT-PCR和RACE结合的方法,克隆了苦荞黄酮代谢途径中关键酶基因F3H,命名为FtF3H(GenBank登录号:FJ456858)。序列分析结果表明,FtF3H基因长1369bp,编码367个氨基酸,该氨基酸序列及其cDNA序列与葡萄、牵牛F3H等的同源性约80%。二级结构预测表明,随机卷曲是FtF3H蛋白最大量的结构元件,而α-螺旋和β-片层则散布于整个蛋白质中;三维结构建模预测FtF3H蛋白具有铁离子结合位点及2-O-酮戊二酸结合位点等F3H蛋白典型结构。     

UV-C照射对苦荞芽生长及品质的影响

以苦荞为材料,研究了不同时间UV.C照射对苦荞芽生长及品质的影响,结果表明：UV-C照射对苦荞芽株高有一定的抑制作用;UV-C照射可以增加苦荞芽的茎粗,平均增粗4.25%;UV-C照射对苦荞芽根长的抑制作用不明显;短时间UV-C照射抑制苦荞芽鲜重的效应不明显;短时间UV-C照射可以提高苦荞芽叶绿素的含量,平均比对照提高24.58%;UV-C照射可以提高苦荞芽总黄酮和Vc的含量,平均分别提高11.42%和23.38%;短时间UV-C照射可以促进苦养芽氨基酸含量的提高,平均挺高22.52%,长时间照射降低苦养芽氨基酸的含量.     

苦荞辐照突变体黄酮含量与PAL活性和农艺性状研

对苦荞辐照突变体黄酮含量和PAL活性以及农艺性状及其它们之间的相关性和显著性的研究得出：养麦种子萌发期黄酮含量与PAL活性在同一时期相关性不显著,呈平行变化关系;在苦荞高黄酮突变体选育过程中单株粒数、单株粒重、主茎分枝数和株高是重要的参考指标。对苦荞突变体综合特征进行分析得出：突变体A3和A4、突变体B2和B4、突变体C3和C5的品质综合指标较对照品种有很大的改善,特别是黄酮含量有明显的提高。     

苦荞TBW16重组表达及靶向结合蛋白的初步分析

苦荞16kD过敏蛋白(Tartary buckwheat 16kD allergen,TBW16)是定位于种子胚中的过敏蛋白,其生物学功能未知。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得苦荞过敏原TBW16基因的序列为基础,构建TBW16成熟蛋白的原核表达载体pET47b-TBW16,实现了其在大肠杆菌BL21Star(DE3)中的高效表达。结果表明:该过敏原以包涵体的形式表达,经包涵体复性及金属离子螯合层析纯化了目标蛋白;以1,4丁二醇二缩水甘油醚环氧基介导的蛋白偶联技术固定化TBW16于Sepharose CL 6B上,采用亲和层析分离与TBW16靶向结合的蛋白,MALDI-TOF质谱鉴定显示,苦荞TBW16过敏原靶向结合蛋白与细菌膜孔蛋白高度同源,该研究结果为分析苦荞TBW16生物学功能奠定了基础。     

一种苦荞主要过敏原基因cDNA的克隆及序列分析

为了获得苦荞中主要过敏原的cDNA和由此推导的蛋白质序列 ,分析其结构特点 ,以苦荞幼根根尖为材料 ,提取总RNA并反转录mRNA为cDNA第一链 .通过RT PCR、3′RACE、基因克隆及序列测定 ,获得一种苦荞主要过敏蛋白基因的cDNA片段 (GenBank登录号为AY0 4 4918) .该cDNA片段由 76 8bp组成 ,包括 3′端非编码区 180个bp ,开放阅读框 5 88bp .可编码一个由 195个氨基酸残基组成的功能蛋白及一个终止密码 .苦荞主要过敏原基因与甜荞 2 2kD过敏蛋白、豆球类蛋白的核苷酸序列分别有 95 %和 93%的同源性 .其推导的氨基酸序列与甜荞球蛋白、刀豆蛋白、甜橙柠檬素分别有 93%、83%和 5 7%的同源性 .该过敏蛋白 183～ 188位氨基酸残基KEEEKE在多数不同过敏原中均存在 ,推测可能为其中的抗原决定簇序列     

苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化

高效分离原生质体是遗传转化、细胞融合和再生培养的基础性工作。该实验以苦荞(Fagopyrum tartaricum)品种‘榆6-21’的叶肉细胞为材料,研究了酶类组合、甘露醇浓度、酶解时间以及离心速度对苦荞叶肉细胞原生质体分离纯化的影响。结果表明:酶解液组成为1.5%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.5mol/L甘露醇+20mmol/L MES+20mmol/L KCl+10mmol/L CaCl2+0.1%牛血清白蛋白,以第5~7片真叶为材料,用胶带纸撕去叶片下表皮后,25℃黑暗酶解4h,以900r/min离心收集,可以获得高质量的原生质体,原生质体产量可达6×106个/g,活力达到90%以上;用双荧光素酶报告基因载体检测原生质体的转化效率,以分离纯化的苦荞叶肉细胞原生质体为受体,将双荧光素酶报告基因载体与其混合后,在终浓度为20%PEG4000介导下,黑暗转化20min,可以检测到较高活性的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶,证明双荧光素酶报告载体可成功转化到原生质体中。研究结果为苦荞原生质体瞬时转化及遗传操作提供了技术基础。     

干旱胁迫对不同苦荞品种苗期生长和根系生理特征的影响

采用盆栽人工控水试验,研究了不同水分处理(正常供水、中度干旱和重度干旱)对耐旱型(‘迪庆苦荞’、‘西农9909’)和不耐旱型(‘西荞1号’和‘黑丰1号’)苦荞品种苗期生理、形态指标的影响,并通过隶属函数法与主成分分析对品种抗旱性进行综合评价,以揭示苦荞苗期的抗旱生理机制。结果表明:(1)与正常供水相比,除‘迪庆苦荞’和‘西农9909’在重度干旱胁迫下主根长呈升高趋势外,其余苦荞品种在2个干旱条件下的株高、茎粗、叶面积、地上部干重、地下部干重、根系体积、根系表面积均呈下降趋势,且耐旱品种降幅小于不耐旱品种;重度干旱胁迫使得‘迪庆苦荞’的根冠比升高,而其余品种根冠比在干旱胁迫下均无显著变化。(2)干旱胁迫使苦荞叶片的叶绿素含量、相对含水量、最大荧光产量(Fm)、最大光化学效率(Fv/Fm)、根系活力和可溶性蛋白含量显著降低,而根系超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)、可溶性糖及游离脯氨酸含量呈升高趋势;不同抗旱性品种间的升降幅度存在差异。(3)各苦荞品种耐旱能力综合评价值(D)表现为‘迪庆苦荞’‘西农9909’‘黑丰1号’‘西荞1号’;幼苗株高、地下部干重及根系SOD活性和蛋白质含量与D值呈显著正相关关系,而根系脯氨酸含量和可溶性糖含量与D值呈极显著正相关关系。研究发现,在中度与重度干旱逆境下,苦荞品种‘迪庆苦荞’和‘西农9909’综合表现较好,具有更强的耐旱能力,而品种‘西荞1号’和‘黑丰1号’综合表现较差,其抗旱性较弱;苗期株高、地下部干重以及根系SOD活性、蛋白质含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量可作为苦荞抗旱性快速鉴定的指标。     

苦荞多肽的纯化、结构与体外抗氧化活性研究CSCD

为了探究苦荞多肽粗提液抗氧化活性的主要来源,需要进一步对苦荞多肽进行分离纯化,通过结构鉴定来分析抗氧化活性与多肽结构之间的关系。该研究以苦荞功能提取物废渣为原料提取苦荞粗蛋白辅以植物乳杆菌发酵法制备苦荞多肽,采用大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶、液相色谱对苦荞多肽粗提液进行分离纯化,并以抗氧化活性为指标,筛选抗氧化活性较强的组分,利用液相色谱-质谱联用技术鉴定抗氧化多肽结构。结果表明,纯度不同的苦荞多肽抗氧化能力也不同,经过Sephadex G-15葡聚糖凝胶分离纯化得到的T-3组分ABTS和DPPH自由基清除能力最优,清除率分别为96%、94%。纯化后苦荞多肽的抗氧化活性显著高于粗提液(P<0.05),但是抗氧化活性并没有完全与苦荞多肽纯度呈正相关,通过液相色谱进一步分离纯化T-3组分后得到的组分T-3-1,苦荞多肽纯度虽然达到了98%,但是对DPPH和ABTS抑制率不再增强,反而稍有下降,抑制率分别为89%和90%。由质谱鉴定结果得到,主要抗氧化肽的氨基酸序列为苯丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸Phe-Pro-Tyr(FPY)和酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸Tyr-Leu-Pro-Phe(YLPF)。研究结果以期为苦荞多肽的进一步开发利用提供一定的理论基础。     

苦荞杂交后代优良株系筛选研究

对来源不同的9个苦荞品种的开花日数、株高、一级分枝数等9个农艺性状进行了Tukey的多重比较和主成分分析,筛选出性状间有显著差异的6个品种,进行了不完全双列杂交。根据对不完全双列杂交亲本间差异的分析结果,从中筛选出株高、一级分枝数等6个性状有显著遗传性差异的2个品种,测定其分离后代(F2和F3)各农艺性状的遗传模式和遗传相关。在北陸4号和石荞的F4中发现了12个优良单株(早熟、矮秆、高产),并根据苦荞各农艺性状的遗传特性,讨论了筛选优良株系的选拔方法。结果表明,利用杂交育种法筛选优良株系时,首先利用SSD法繁殖至F4,再利用系统育种法来选拔最为有效。     

苦荞谷胱甘肽转移酶(FtGST)基因的克隆与序列分析

采用RACE技术,从苦荞(Fagopyrum tatarium)中克隆得到一个谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase protein,FtGST)基因。序列分析表明,FtGST基因全长DNA序列和cDNA序列编码区分别为746 bp和666 bp,DNA序列含有一个长度为80 bp(342-421 bp)的内含子;开放阅读框(ORF)长666 bp,编码221个氨基酸。生物信息学分析表明,FtGST基因推导的蛋白质含有Tau家族典型的底物结合口袋、谷胱甘肽结合位点(G-site)和疏水性底物结合位点(H-site)氨基酸残基,表明FtGST为Tau家族蛋白。