酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用*

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值。方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率。随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响。首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率。结果:酵母培养144~192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低。根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%~28%。结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比。sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性。两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值。     

Grazing-induced legacy effects enhance plant adaption to drought by larger root allocation plasticity

放牧诱导的植物遗留效应可以通过较大的根系分配可塑性增强其干旱适应性 为探索植物的放牧遗留效应是否有利于天然草原生态系统应对干旱环境,我们采集了 内蒙古典型草原自由放牧和多年围封样地内的冰草(Agropyron cristatum)和黄囊苔草(Carex korshinskyi)幼苗 进行了温室控水试验。研究结果表明,干旱处理对自由放牧样地采集的冰草和黄囊苔草子株生物量、子株数量和总生物量的影响较小;自由放牧区的冰草与黄囊苔草较强的干旱适应性可部分由干旱处理下较大的根系分配可塑性来解释。本研究结果表明合理放牧是天然草原适应气候变化的潜在管理办法之一。     

马铃薯致病疫霉研究进展

马铃薯致病疫霉(Phytophthora infestans)属卵菌纲(Oomycetes)霜霉目(Peronosporales)腐霉科(Pythiaceae)疫霉属(Phytophthora),是马铃薯和番茄晚疫病病原菌。由于晚疫病对马铃薯生产的毁灭性和严重性,对致病疫霉的研究一直是关注的重点。本文首先对病害引起的症状、发生特点及流行规律进行阐述,对有性生殖发生的遗传规律和多种交配型共存的大环境下病原菌群体结构变异特点进行归纳总结。随着2009年致病疫霉基因组测序的完成,本文比对了疫霉属目前已完成测序各个种的基因组学特点,介绍了致病疫霉在效应子克隆方面的研究进展及线粒体基因组研究现状,阐述了功能基因组学的两个重要技术:高密度遗传连锁图谱(high density linkage mapping)和全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS),及其在挖掘致病疫霉重要功能基因上的应用。本文有助于了解致病疫霉研究热点及后续突破方向,可为深入解析致病疫霉的功能基因及致病机制提供参考,对开发马铃薯晚疫病菌药物靶标及预测病害的大规模流行趋势也具有重要意义。     

T细胞的效应功能受有氧糖酵解的转录后调控

非增殖细胞将葡萄糖代谢为丙酮酸,进而进入线粒体的三羧酸循环,通过氧化磷酸化产生还原当量和ATP。然而,增殖细胞如激活的T细胞和癌细胞,它们进行糖酵解,在胞浆中将丙酮酸代谢为乳酸,有充足的氧气可以进行氧化磷酸化(OX-PHOS)。这一现象被称为Warburg效应。显然,后者在提供能量方面效率不如前者,提示这一过程可能有其他功能。之前有学者认为有氧糖酵解在增殖产生子细胞营养物质生物合成的过程中是必需的。但是氧化磷酸化转变为有氧糖酵解是T细胞激活而不是增殖的标志,所以作者希望探索有氧糖酵解对T细胞是否有增殖以外其他方面的功能。他们的研究成果发表在2013年6月6日在线出版的《细胞》(cell)杂志上。     

捕食风险的种群动态效应及其作用机理研究进展

捕食者不但可以通过直接捕杀猎物而控制猎物的种群数量,还可以通过捕食风险效应影响猎物种群的繁殖和动态,并且在某些情况下,捕食风险效应对猎物种群动态的控制作用甚至大于捕食者的直接捕杀.关于捕食风险效应对猎物动物繁殖产出和种群动态变化的作用及其机理方面的野外研究越来越受到国内外学者重视.本文介绍了近年来捕食风险效应的研究进展,重点关注了美国黄石国家公园中捕食者对马鹿(Cervus elephus)、加拿大育空地区的捕食者对白靴兔(Lepus americanus)的捕食风险效应等案例研究,以阐明捕食风险效应对猎物种群动态影响的重要性,以及关于捕食风险效应影响猎物种群繁殖和动态机理的两个假说(捕食者敏感食物假说、捕食应激假说).并结合我国在捕食者与猎物之间关系的研究现状,提出了进一步在野外开展捕食风险效应对濒危有蹄类猎物种群动态影响研究的建议,阐释了开展这些研究的重要意义.     

基于细菌群感效应人工构建分子开关

对生物体内已有的或者人工组装的生物合成途径进行优化操作涉及两个重要问题:代谢途径中关键酶的活性及蛋白表达水平。对于酶表达水平的研究,传统的做法是采用强启动子控制下的靶蛋白过量表达策略。靶蛋白的过量表达通常会导致细胞内积累大量的无活性包涵体,从而严重影响细胞的生理状态和相关生物途径的有效运转。针对这一问题,设计一种分子开关来精确调控生物合成过程中关键酶的表达水平,对于研究生物合成途径的代谢节律以及促进生物合成途径高效运转都具有重要的实用价值。基于细菌群落中普遍存在群感效应的基本原理并结合酶促催化的动力学特征,首先在大肠杆菌群落中建立信号分子高丝氨酸内酯(AHL)介导的细胞–细胞交流机制,将靶基因egfp置入到启动子PluxI的控制之下。在细胞生长过程中,产生的AHL累积到一定浓度启动靶基因表达。通过在细胞生长的不同阶段启动AHL降解酶AiiA的表达控制环境中信号分子AHL的浓度水平,从而控制靶基因egfp的转录效率,最终实现对靶蛋白EGFP表达水平的精确控制。通过检测细胞的生长状态、靶基因在mRNA水平、蛋白质水平的表达情况证明人工设计的分子开关可以便捷高效地控制靶基因表达水平,具有时空调节的严谨性。该分子开关有望广泛应用于代谢工程和合成生物学等研究领域中。     

科尔沁沙地生态防护体系防护效应评价

以科尔沁沙地乌兰敖都村为研究对象,通过对研究区6类主要土地利用类型的6项评价指标建立层次结构模型,运用层次分析法(AHP法),对研究区6类土地利用类型生态防护体系防护效应进行科学评价.防护效应得分情况为:乔木林地0.263、灌木林地0.170、草场0.206、固定沙丘0.169、半固定沙丘0.103和流动沙丘0.088,以不同土地利用 类型占全区总面积的比例为权重,计算研究区生态防护体系防护效应总体得分为0.133,仅为乔木林地生态防护体系防护效应得分的50.6％,通过绿化造林和防风固沙等措施,研究区相对防护效应理论上可提高至67.2％.而受气候、土壤和人类干扰等多种因素影响,科尔沁沙地生态防护体系防护效应仍处于较低水平.面临生态环境建设与国家政策和地区经济发展之间的矛盾,提高沙地防护体系防护效应是长期而艰巨的任务.     

新农合对村卫生室能力建设的激励效应

以贵州省24个县村卫生室为样本,利用准实验对照研究探讨新农合对卫生室的激励效应。结果表明,新农合定点组的设施和人力配备以及功能服务和收益的大部分指标值及其增幅优于非定点组。新农合在一定程度上促进了卫生室的发展,但需进一步提高对卫生室的覆盖面和补偿力度,完善支付方式,并加大财政支持,提升卫生室服务能力,以达到医保双方良性互动的局面。     

马尾松和苦槠林根际土壤矿化和根系分解CO2释放的温度敏感性

以中亚热带马尾松林和苦槠林为对象,原位收集根际和非根际土壤、树木不同生态功能的根系,开展15℃、25℃、35℃和45℃恒温培养模拟试验,采用密闭气室碱液吸收法测定53 d内CO2释放的动态变化.结果表明:两种森林类型不同温度下土壤矿化CO2释放速率的根际效应介于1.12 ～3.09,且培养前期高于培养后期;15℃下马尾松林和苦槠林差异不显著,25℃和35℃下前者低于后者,45℃下则相反.不同培养温度下两树种吸收根分解的CO2释放速率均高于过渡根和贮存根,且马尾松均低于苦槠.两种森林类型CO2释放的Q10值均为土壤(1.21 ～1.83)显著高于根系(0.96 ～1.36).两种森林类型土壤矿化CO2释放的Q10值差异不显著,而马尾松根系分解CO2释放的Q10值高于苦槠.推断全球变暖导致的土壤矿化CO2释放的增量将远远高于根系分解,且马尾松林高于苦槠林;地带性顶极群落应对气候变化的抵抗力强于先锋树种群落.