腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔骨骼肌Ldhc基因的沉默效果

腹腔注射是一种简单且方便给药的方式,为了验证腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc对高原鼠兔(Ochotonacurzoniac)骨骼肌Ldhc基因沉默的可行性,将27只高原鼠兔分为干扰组、空壳组和空白对照组,每组各9只个体,干扰组和空壳组分别注射0.65ml腺病毒pMultiRNAi-Ldhc和腺病毒pMultiRNAi-NS,空白对照组注射等量生理盐水,注射后7d检测骨骼肌中Ldhc基因mRNA和蛋白的表达水平,测定了乳酸脱氢酶(LDH)活性和乳酸(LD)及三磷酸腺苷(ATP)的含量。结果表明,与空白对照组相比,干扰组在mRNA和蛋白水平上,Ldhc基因表达分别降低了41.73%和15.76%;乳酸脱氢酶(LDH)活性、乳酸(LD)和ATP含量分别降低了23.98%、51.08%和19.29%。结果说明,腹腔注射腺病毒pMultiRNAi-Ldhc能有效沉默骨骼肌中Ldhc基因表达。     

腺苷对颈动脉窦压力感受器反射的易化作用

在27只隔离灌流颈动脉窦区的麻醉大鼠,观察了腺苷（adenosine,Ado）对颈动脉窦压力感受器反射的影响。所得结果如下：（1）以 Ado（125μmol／L）隔离灌流大鼠左侧颈动脉窦区时,压力感受器机能曲线向左下方移位,曲线最大斜率（PS）由0．37±0．02增至0 55±0．02kPa／KPa（P＜0．001）,反射性血压下降幅度（RD）由5．53±0．12增至7．76±0．36KPa;阈压（TP）、平衡压（EP）和饱和压（SP）则分别从8．60±0．27,12．53±0．30和23．69±0．15下降至5．63± 0．11kPa,10．89±0．29KPa和20．18±0．55KPa（P＜0．01－0．001 ）。其中RD,PS和TP的变化呈明显的剂量依赖性。（2）用腺苷选择性 A1受体拮抗剂（8－cyclopentyl－l,3－dipropylianthene,0．134mmol／L）预处理后,Ado的上述反射效应即被阻断。（3）先给予KATP通道阻断剂格列苯脲（glibenclamide．10μmol／L）亦可取消腺苷对压力感受器反射的影响。以上结果表明, Ado对大鼠颈动脉窦压力感受器活动有易化作用,这一作用似与腺苷A1受体介导的KATP通道开放有关。     

水稻细胞质1,6-二磷酸果糖酶基因1 195 bp的上游调控序列的克隆及其在转基因水稻中的表达研究

1,6-二磷酸果糖酶(EC3.13.11)催化1,6-二磷酸果糖分解为6-磷酸葡萄糖和无机磷酸.在高等植物的光合作用细胞中,存在两种1,6-二磷酸果糖酶:即叶绿体型1,6-二磷酸果糖酶和细胞质型1,6-二磷酸果糖酶.由于细胞质型1,6-二磷酸果糖酶在植物碳水化合物代谢中起重要作用,且具有表达特异性,本试验通过Genome Walking分离了水稻细胞质型1,6-二磷酸果糖酶基因的上游序列,并将其与β-葡糖醛酸酶(GUS)报告基因构建成嵌合表达载体.采用基因枪法转化水稻,在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.组织化学检测表明,在转基因水稻的成熟叶片中,GUS基因只在叶肉细胞中表达,在表皮细胞、泡状细胞、维管组织中均无表达;在叶鞘中的表达与叶片中相似,仅仅在叶肉细胞中表达;在根、茎所有细胞中均没有蓝色反应.为进一步研究1,6-二磷酸果糖酶基因启动子在水稻中的表达量,对12株独立来源的转基因水稻的GUS 活性进行了荧光定量分析.结果显示,水稻成熟叶片中的GUS活性平均值为7 031.5 pmol 4-MU-1*min-1*mg蛋白.在不同器官及组织中表达活性有差异,在转基因水稻的叶片、叶鞘中GUS均有较强的表达,在根、茎中未检测到GUS活性.实验结果表明,ATG上游1 195 bp调控区足以导致GUS基因在水稻中的特异性表达,因此该片段包含有使报告基因在叶肉细胞中特异性表达的所有顺式调控元件.     

酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

[目的]为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;[方法]构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apaldn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性.将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经.IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况.将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex 75分子筛纯化.纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛.[结果]成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apaldn16蛋白.得到了分子量约为36 kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上.质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确.将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶.此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apaldn16蛋白晶体.[结论]利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apalan16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究.     

腺苷对豚鼠蜗内直流电位的影响

用外淋巴灌流给药方法,观察了腺苷及其摄取抑制剂对嘧啶氨醇、以及腺苷受体拮抗剂茶碱对豚鼠蜗内直流电位（ＥＰ）的影响,并进行了耳蜗组织学观察。发现腺苷对ＥＰ有明显压抑作用,氧法观察负ＥＰ（Ｎ－ＥＰ）无明显改变;灌流双嘧啶氨醇,增加内源性腺苷,出现相似变化;灌流茶碱则使ＥＰ升高。本文讨论了腺苷对ＥＰ可能作用机制。     

鸡肝6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2-,6-二磷酸酯酶单克隆抗体制备及对酶活力影响

利用鸡肝-6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase)的单克隆抗体对其结构和功能进行了初步研究.用鸡肝6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase为抗原免疫Balb/C小鼠,最后获得7株单克隆抗体.其中6株抗体的抗原决定簇位于6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase的酯酶结构域部分,而另一株H₂的抗原决定簇则位于其激酶结构域部分.7株单克隆抗体都能引起鸡肝6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase的激酶活力提高2倍左右,而对酯酶活力的影响大致相同.它们激活该酶的酯酶活力至4倍左右,但却不影响分离的鸡肝果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域的酯酶活力.以上结果再次提示6PF-2-K/Fru-2,6-P₂ase双功能酶和分离的Fru-2,6-P₂ase结构域的酯酶处于2种不同的构象和活性状态.     

鸡肝果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域的初步晶体学研究

从鸡肝6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶分离的果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域(残基245～468)已在E.coli中获得高效表达,并经分离得到纯化,使用悬滴气相扩散法成功地培养出该果糖-2,6-二磷酸酯酶结构域单晶.该酶晶体属于四方晶系,空间群为P4₁2₁2或P4₃2₁2,晶胞参数为:a=b=10.02nm,c=13.98nm,α=β=γ=90°.晶胞内每个结晶学不对称单位含有2个果糖-2,6-二磷酸酯酶分子.利用日本 Photon Factory同步辐射光源收集了分辨率为 0.32 nm的母体衍射据.