三七内切-β-1,4-葡聚糖酶基因PnCel1的表达及功能分析

内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-β-glucanases,EGases)广泛参与植物细胞壁的编辑,在组织伸长、果实成熟和脱落等过程中起重要作用。该研究采用RT-PCR方法,从三七(Panax notoginseng)中克隆了1个EGases基因(PnCel1),并对其进行表达和功能分析。结果显示:(1)外源茉莉酸甲酯、水杨酸、赤霉素、脱落酸和乙烯利处理显著诱导PnCel1的表达,而根腐病菌茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)以及交链格孢(Alternaria alternata)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)侵染三七后显著抑制PnCel1的表达。(2)亚细胞定位分析表明,PnCel1-GFP融合蛋白定位于洋葱表皮细胞的细胞壁中。(3)采用染色体步移技术克隆出PnCel1的启动子序列[(-1)~(-828)bp],进而成功构建PnCel1启动子驱动的β-葡萄糖醛酸酶植物表达载体(pBI121-PPnCel1-GUS)并转入烟草(Nicotiana tabacum L.),经PCR筛选鉴定获得阳性转基因烟草7株。(4)GUS活性检测结果表明,5种植物激素能诱导PnCel1的启动子活性,但茄腐镰刀菌等4种病原菌侵染明显降低了PnCel1启动子的转录活性,且PnCel1启动子受三七WRKY转录因子PnWRKY5/9/12/15/27的负调控。(5)PnCel1过表达转基因烟草与野生型烟草相比,对茄腐镰刀菌的易感性增加,木质素含量降低,表明PnCel1可能参与改变细胞壁的结构。研究表明,植物激素能上调三七根中PnCel1的表达,而病原菌侵染降低了PnCel1的表达水平,并抑制PPnCel1的活性,推测三七PnCel1可能通过改变细胞壁结构而增加三七对根腐病菌的易感性。     

层孔菌产漆酶的摇瓶最适培养条件研究

筛选到一株高产漆酶的层孔菌W－1,对其兴体产漆酶的培养条件进行了优化,确定了最适的碳源、氮源,并用正交试验确定了培养基中碳源和氮源的浓度。在最优化的培养条件下,培养7d后,W－1产生的漆酶活力可以达到7．1U／mL。采用补料的方法,可以得到大量的漆酶粗酶液。     

影响深红酵母和白地霉产生胞外蛋白和多肽的因素

采用白地霉2.498-47在以蛋白胨为氮源发酵时,只在开始pH3.2左右产生胞外蛋白,NH_4~+则无此限制,还有助于胞外多肽的产生。深红酵母2.280胞外蛋白的最大产率约在pH5.8;尿素作唯一氮源效果最好,与蛋白胨合并使用,可产胞外蛋白约800μg/ml。酵母膏对生长和产胞外蛋白很必要,不能用玉米浆和麦芽汁代替。用0.05N NaOH浸洗不同pH和氮源所培养的细胞都能浸出胞内蛋白,接近400μg/ml。发酵产生胞外蛋白自一日后开始,至二日接近最大量,以后逐渐减少。多肽产生起自第二日,五日未达到最大量。两株酵母菌都不表现蛋白酶活性,因此这个现象还不能解释。     

L—山梨糖提高木霉纤维酶合成速率机制的研究

在０．５％葡萄糖－Ｍａｎｄｅｌｓ盐培养液中添加终浓度为０．５％的Ｌ－山梨糖,可使里斯木霉和拟康氏木霉的内切外外切β－１,４葡聚糖酶合成速率在培养的２天内提高４倍。与此同时β－葡萄糖苷酶的合成没有明显变化。Ｌ－山梨糖能明显抑制菌丝生长,但对葡萄糖的吸收没有影响,对菌丝分泌纤维素酶的机制影响不大。其对酶合成的促进可能主要是通过降低了菌丝体的生长速率。     

根霉葡萄糖淀粉酶的复性复活动力学研究

本文利用荧光、紫外差光谱研究了根霉葡萄糖淀粉酶在盐酸胍变性后的复性、复活动力学。结果表明,该酶在小于4mol/L盐酸胍中变性是可逆的,其复性过程遵循一级反应方程。酶复活过程是由两个一级反应组成的复合反应,构象变化速度与复活过程中较快的反应速度相差无几,这可能是在Trp及Tyr微区的构象变化基本完成之后,酶活力恢复还没有完成造成的。     

福廷瓶头霉与马尾松的共生特征

深色有隔内生真菌（dark septate endophyte,DSE）广泛定殖于植物根系,对促进植物生长、提高植物抗逆能力具重要作用。本研究从马尾松Pinus massoniana根系分离到一株DSE,于无菌条件下研究了此菌与马尾松的共生特征,研究结果表明：基于形态学和分子生物学分析,此菌被鉴定为福廷瓶头霉Phialocephala fortinii,在PDA培养基25℃培养条件下,此菌不产孢,菌丝深色、具隔,最适培养基为PDA。此菌与马尾松根系共生体的形成过程可划分为3个时期,即侵入前期：接种后2d,新生菌丝向马尾松根系定向生长并开始接触根系,但未侵入根系内部;侵入期：接种后4d,菌丝与马尾松根系接触侵入根内并在根系皮层细胞间扩展延伸;形成期：接种后6d,菌丝继续在马尾松根系内扩展并形成富含脂类物质的微菌核。接种福廷瓶头霉显著增加了马尾松生物量的积累（P<0.05）,并影响了其根系发育。接种后,马尾松主根生长受限,侧根生长显著提高（P<0.05）,侧根长度较未接种处理增加了112.87%。被侵染根系的根毛数量减少,并由大量根外菌丝包裹。以上结果对进一步揭示DSE与宿主的共生机理有一定指导意义。     

花生四烯酸产生菌高山被孢霉的高糖驯化研究

【目的】提高花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)产量,克服ARA产生菌高山被孢霉(Mortierella alpina)在长期的保存及使用过程中易受到外界条件影响发生退化,从而导致菌种耗糖量降低、影响菌种摄入营养的能力和不利于工业化生产的缺点。【方法】首先采用固体培养基驯化,将菌种逐级涂布于梯度高糖PDA平板(含糖量分别为2%、5%、7%、10%和15%)培养,挑选经固体驯化后能耐受10%高糖浓度平板的菌种,转接到两种含不同氮源的梯度高糖(含糖量分别为3%、4%、5%和6%)液体培养基中进行驯化,最后对驯化后的菌种进行2 L发酵罐放大实验。【结果】当培养基中以酵母粉为氮源时,驯化后菌体的最高耗糖量由3 g/(L.d)提高到12 g/(L.d);当培养基中以玉米浆为氮源时,驯化后菌体的最高耗糖量由7 g/(L.d)提高到12 g/(L.d)。摇瓶驯化实验结果表明以玉米浆为氮源驯化的菌种发酵效果较好,发酵罐实验结果显示菌体生物量为50 g/L,总油脂为18 g/L,目的产物ARA产量为8 g/L。相比未驯化之前的发酵结果,生物量和总油脂含量提高了近3倍,ARA产量提高了近4倍。【结论】经过高糖驯化,菌种的耗糖能力得到提高,生物量、总油脂及ARA的产量也都有所增加,从而可以使菌种在保存和使用过程中不易退化,保持稳定。     

西北荒漠带油蒿丛枝菌根真菌空间分布特征

2018年7月和2019年7月,沿荒漠植物油蒿(Artemisia ordosica)天然分布地带,在内蒙古、宁夏、甘肃选取4个典型样地,采集油蒿根围土样和根样,研究丛枝菌根(arbuscular mycorrhiaze,AM)真菌地理分布以及土壤因子的生态功能。共分离鉴定6属32种AM真菌。在低海拔地区(1 000～1 300 m)和高海拔地区(1 600～1 900 m),球囊霉属(Glomus)和无梗囊霉属(Acaulospora)为优势属;在中海拔地区(1 300～1 600 m),球囊霉属和斗管囊霉属(Funneliformis)为亚优势属;盾巨孢囊霉属(Scutellospora)在3个海拔地区均为偶见属,近明囊霉属(Claroideoglomus)在低海拔地区为偶见属,在高、中海拔地区为伴生属;缩管柄囊霉属(Septoglomus)在3个海拔地区均为伴生属。油蒿根围AM真菌定殖分布表现出空间分布特征:从东到西随海拔高度增加,菌丝、泡囊、总定殖率和定殖强度总体呈渐增趋势,最大定殖率为70%,最小定殖率为13.3%。主成分分析表明,氨氮、湿度、脲酶和速效磷是影响AM真菌分布的主要因子。相关性分析表明,海拔与酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脲酶、速效磷极显著正相关(P0.01),与有机碳显著正相关(P0.05),与总提取球囊霉素极显著负相关。