嗜水气单胞菌cpxRA缺失株构建及生物学特性研究

为了探讨Cpx系统在嗜水气单胞菌生长及毒力等方面发挥的作用, 利用融合PCR和基因同源重组原理, 以自杀质粒pRE112为载体构建缺失57—1879 bp序列的cpxR-A基因簇突变株 Δcpx, 然后比较缺失株和野生株在生长、生物膜形成、应激耐受及毒力等生物学特性方面的差异。普通PCR及荧光定量PCR结果验证了突变株中cpxRA基因簇片段的部分缺失, 表明突变株构建成功; 生物学特性研究结果显示, 突变株在形态、生长、生物膜形成及毒力等方面与野生株没有显著差异, 两者主要在应对高渗透压、SDS (十二烷基磺酸钠)刺激及含有EDTA (乙二胺四乙酸二钠)或多黏菌素B环境表现不同。结果表明Cpx双组分系统在嗜水气单胞菌应对外界刺激方面扮演着重要角色, 但在毒力方面则可能处于次要地位。     

大豆异黄酮基于RhoA/ROCK2信号通路改善MCAO大鼠神经功能损伤

目的:探讨大豆异黄酮对脑缺血再灌注大鼠RhoA/ROCK2信号通路介导的氧化应激反应和神经元凋亡的影响。方法:60只SD大鼠随机分为3组,对照组、模型组、大豆异黄酮组。连续给药7天后,给药剂量200 mg/kg。应用中动脉栓塞再灌注模型致大鼠缺血损伤。24 h后评价大鼠神经功能,TTC染色检测脑梗死体积,试剂盒检测脑中氧化因子含量,免疫组化检测神经元损伤,Western Blotting检测RhoA/ROCK2相关蛋白含量。结果:与对照组比较,模型组大鼠神经功能评分降低(P0.05),脑梗死体积增加(P0.05),氧化因子含量增加(P0.05),神经元凋亡显著(P0.05),RhoA/ROCK2蛋白表达增加(P0.05)。与模型组相比,大豆异黄酮升高了大鼠神经功能评分(P0.05),减少的脑梗死体积(P0.05),降低脑中氧化因子含量(P0.05),抑制了神经元凋亡(P0.05),抑制了RhoA/ROCK2蛋白表达(P0.05)。结论:大豆异黄酮可以缓解脑缺血再灌注损伤介导的氧化应激及细胞凋亡,进而减轻神经功能障碍,其机制可能与抑制RhoA/ROCK2信号通路相关。     

红茶菌在脑缺血再灌注损伤大鼠模型中的作用研究

摘要 目的：探讨红茶菌在脑缺血再灌注损伤大鼠模型中是否有改善效果。方法：将48只清洁级SD大鼠根据随机数字表法分为假手术组、模型组、红茶菌组、依达拉奉组。红茶菌组术前给予红茶菌液灌胃7天以及再灌注麻醉清醒后追加灌胃1次,依达拉奉组大鼠在再灌注前15 min经腹腔注射依达拉奉,模型组和假手术组给予生理盐水。遵循Zea Longa线栓法阻断大鼠大脑中动脉血流2 h后恢复再灌注24 h 建立MCAO模型,假手术组大鼠仅分离劲总动脉。再灌注24 h后,神经行为学评分评估脑损伤程度;TTC染色观察红茶菌对大鼠脑梗死面积比的影响并用Image J软件测定梗死面积;HE染色后观察大鼠脑组织皮层神经元病理形态学;透射电镜观察大鼠皮层神经元超微结构及线粒体形态。结果：脑缺血再灌注24 h后,对大鼠进行神经行为学评分,红茶菌组神经神经行为学评分为（2.21±0.60）,依达拉奉组神经行为学评分为（2.01±0.66）,均显著低于模型组（2.52±0.52）（P＜0.05）;TTC染色后观察到模型组大鼠大脑梗死灶明显,红茶菌组与依达拉奉组较模型组大鼠梗死面积明显减小;HE结果显示模型组大脑皮层神经元损伤明显,红茶菌组与依达拉奉组较模型组大脑皮层神经元坏死减轻,梗死面积缩小;透射电镜下观察到模型组大鼠染色质溶解,线粒体肿胀,红茶菌组与依达拉奉组较模型组溶解减少,线粒体结构较完整。结论：红茶菌可减轻脑缺血再灌注损伤大鼠模型的神经元损伤,有望成为改善脑缺血再灌注损伤的疗法或辅助疗法。     

牡荆素对大鼠脑缺血再灌注损伤后的小胶质细胞/巨噬细胞M2极化的影响

摘要 目的：探究牡荆素（Vitexin）对大鼠脑缺血再灌注损伤（CIRI）后的小胶质细胞巨噬细胞M2极化的影响。方法：采用改良的Longa法建立大鼠右侧中动脉阻塞/再灌注（MCAO/R）模型。建模后,将大鼠分为假手术组（Sham,n=10）、MCAO/R组（n=12）、Vitexin组（n=12）和Vitexin+脂多糖（LPS）组（n=12）。Sham组和MCAO/R组腹腔注射2 mL 0.9%生理盐水,Vitexin组腹腔注射2 mL牡荆素溶液（3 mg/kg）,Vitexin+LPS组腹腔注射1 mL牡荆素溶液（3 mg/kg）和1 mL LPS溶液（0.5 mg/kg）。1次/d,连续14 d。给药14 d后,根据Zea Longa 5分法对大鼠进行神经功能评分。通过2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）法检测脑梗死体积。采用双重免疫荧光染色方法检测大脑缺血半影区CD16/32+/Iba1+、CD206+/Iba1+的共表达。通过qRT-PCR或Western blot检测大脑缺血半影区Toll样受体4（TLR4）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-1β、IL-4、IL-10、核因子-κB（NF-κB）p65的mRNA或蛋白表达。使用商用试剂盒检测大脑缺血半影区丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的含量。结果：与MCAO/R组相比,Vitexin组神经功能评分降低,脑梗死体积降低,MDA水平降低,SOD和GSH-Px水平升高（P<0.05）。与MCAO/R组相比,Vitexin组CD16/32+/Iba1+的阳性细胞数量降低,CD206+/Iba1+的阳性细胞数量升高,TNF-α和IL-1β的mRNA水平降低,而IL-4和IL-10的mRNA水平升高（P<0.05）。与MCAO/R组相比,Vitexin组TLR4 mRNA和蛋白水平降低,细胞核NF-κB p65的蛋白表达水平降低（P<0.05）。然而,LPS给药逆转了牡荆素对上述指标的影响（P<0.05）。结论：牡荆素部分通过TLR4/NF-κB信号通路促进大鼠CIRI后小胶质细胞/巨噬细胞向M2表型极化,从而促进神经功能恢复。     

分别利用产甘油假丝酵母抗逆转录因子CgSTB5和CgSEF1对酿酒酵母菌株糠醛耐受改造

【背景】纤维素是生物转化解决能源问题的主要原料之一,其水解物中存在严重影响抑制菌株生长的糠醛,需脱毒才可应用于发酵,提高菌株耐受性是解决纤维素水解液实际生产应用的关键。【目的】酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是主要的纤维素水解液发酵工业菌株,但糠醛耐受性较低,通过分子改造获得具有高糠醛耐受性的菌株。【方法】利用新获得的产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)的相关抗逆转录因子CgSTB5、CgSEF1和CgCAS5,通过分子技术进行S.cerevisiae改造,考察其对酿酒酵母糠醛耐受性的影响,并尝试应用于未脱毒纤维素乙醇发酵。【结果】单个表达CgSTB5和CgSEF1的酿酒酵母,通过菌株点板实验表明菌株的糠醛耐受性提高25%以上,并且摇瓶发酵结果显示糠醛降解性能明显提高,生长延滞期明显缩短,S.cerevisiae W303/p414-CgSTB5的未脱毒纤维素乙醇发酵生产效率提高12.5%左右。【结论】转录因子CgSTB5和CgSEF1均能对提高酿酒酵母糠醛耐受性起到重要作用,并且有助于提高酿酒酵母菌株未脱毒纤维素乙醇发酵性能。     

小鼠脑缺血再灌注模型稳定性研究

目的:探讨影响小鼠脑缺血再灌注模型成功率,梗死体积以及行为学评分稳定性的因素。方法:采用昆明小鼠75只,体重为20-23 g,随机分为5组,比较在不同长度的线栓以及不同进栓深度的条件下对小鼠脑缺血再灌注模型成功率,梗死体积以及行为学评分的稳定性的影响。同时术中行脑血流监测,比较各组小鼠大脑中动脉脑血流下降的差异。结果:规格1组,模型成功率为40%,梗死体积为(16.7±9.3)%,神经功能缺损评分(NSS):7.2±2.4,大脑中动脉(MCA)血流下降百分比:(86.9±4.2)%;规格2组,模型成功率为46.7%,梗死体积百分比为(19.2±11.6)%,NSS:8.8±2.5,MCA血流下降百分比:(87.4±3.8)%;规格3组,模型成功率为33.3%,梗死体积百分比为(16.6±9.6)%,NSS:8.2±2.6,MCA血流下降百分比:(88.3±3.4)%;规格4组,模型成功率为86.7%,梗死体积百分比为(23.4±2.2)%,NSS:13.9±1.3,MCA血流下降百分比:(87.5±3.5)%。结论:1.小鼠脑缺血再灌注模型稳定性关键因素在于线栓能对后交通动脉(PComA)和大脑前动脉(ACA)起始段形成有效栓塞。2.小鼠大脑中动脉血流监测并不能作为评价小鼠脑缺血再管注模型成功与否的主要依据。     

灯盏甲素在大鼠脑缺血再灌注损伤模型的PK-PD结合模型研究北大核心CSCD

本研究旨在建立辛芍组方中灯盏甲素的PK-PD结合模型。首先采用液质联用法测定大鼠脑缺血再灌注损伤模型给药后的不同时间点所得血浆样本中灯盏甲素的药物浓度,获得药时曲线;同时采用试剂盒测定不同时间点所得血浆样本中的两种药效指标(SOD和LDH),获得时效曲线。然后用Win Non Lin软件采用房室模型的分析方法对灯盏甲素的药代动力学参数进行拟合,获得PK参数。在此基础之上,固定相关的药代动力学参数,对时效关系进行拟合,得到相关的PD参数,根据PD参数,建立辛芍组方中灯盏甲素的PK-PD结合模型。当以SOD为药效指标时,可得辛芍组方中灯盏甲素的PK-PD模型为E=20.67+(1.22×Ce)/(Ce+5.58);当以LDH为药效指标时,可得辛芍组方中代表成分灯盏甲素的PK-PD模型为E=214.17-(32.72×Ce)/(Ce+0.08)。结果表明,SOD和LDH的浓度与灯盏甲素的浓度存在一定的相关性。辛芍组方及其主要活性成分灯盏甲素可通过提高SOD、降低LDH发挥抗氧化作用来实现保护脑缺血再灌注损伤。     

局部脑缺血－再灌注大鼠行为和运动功能的动态观察

采用定量的方法动态观察局部脑缺血－再灌注大鼠的行为和运动能力,旨在为缺血性脑损伤行为评价提供敏感的指标。用直径０．２ｍｍ的尼龙线经颈内动脉可逆性插入到大脑前动脉,建立局部脑缺血－再灌注大鼠模型。术后１、２、４、８、２４、４８ｈ观察神经症状。运动能力的评价采用握－引测验、网屏测验和转棒测验,在术后１、２、３、７、１４ｄ进行。主要结果如下：该模型的偏瘫很快消失,术后４ｈ就难以用肉眼观察出运动的异常。而提尾悬空试验的阳性体征持续到术后３ｄ,转棒的成绩在术后１周恢复正常。握－引和网屏测验未能显示出肌力的异常,应考虑设计更完善的方法以排除干扰因素。上述结果提示提尾悬空和转棒测验是评价脑缺血大鼠运动缺陷的简便、客观且较敏感方法。     

急性重复缺氧对小鼠脑组织腺苷及其A1受体的影响

分别应用酶鉴别分光光度法和放射性配体结合法测定小鼠脑组织腺苷（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ,ＡＤＯ）含量及Ａ１受体在急性重复缺氧过程中的变化。发现经急性重复缺氧处理的动物全脑内ＡＤＯ含量有一定程度的累积增加,尤其在海马、脑桥和延髓处的增加较为显著;各脑区Ａ１受体的数目显著低于正常对照组,但海马、脑桥和延髓处Ａ１受体的亲和力显著高于正常对照组。结果提示,重复缺氧后虽然脑内Ａ１受体数目减少,但由于海马、脑桥和延髓处Ａ１受体的亲和力升高,累积增加的ＡＤＯ和Ａ１受体结合后,抑制神经细胞兴奋性的作用仍可能得到加强,从而使ＡＤＯ仍能更好地发挥抑制性神经调制作用。     

基于目标基因芯片数据预测lncRNAs调控脑缺血再灌注损伤后的作用效应

长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)在细胞中有重要调控作用。已有研究报道,脑缺血再灌注损伤可诱导大量lncRNAs表达水平的改变,然而其具体作用机理未知。现从GEO数据库中下载基因芯片数据,分析损伤后脑组织中lncRNAs和mRNAs的表达改变。结果显示27条lncRNAs和408条mRNAs表达上调,9条lncRNAs和31条mRNAs表达下调。同时,基因本体论和通路富集分析显示差异表达的转录本在免疫和炎症反应、细胞凋亡调控等生物过程及相关通路显著富集。此外,基于lncRNAs目标预测程序和lncRNAs-mRNAs共调控网络,对序列数据和表达数据进行综合分析,发现差异表达lncRNAs参与调控细胞凋亡、免疫和炎症反应,并推测出linc RNA(chr1 9:5771 425-5848475_F)、lincRNA(chr1:1 37503023-1 37625604_R)和lincRNA(chr1 4:21 029450-21 049451_F)等lncRNAs潜在的靶基因和调控机制。这些发现提示lncRNAs广泛参与调控脑缺血再灌注损伤,为缺血性脑卒中损伤机制和治疗方案提供新的研究方向。