可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测

本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确,sTNFRII-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明,sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此,本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。     

一种新型改良硫氧还蛋白融合表达体系的建立及cathelicidin家族Lf-CATH2的表达

通过改良硫氧还蛋白融合表达体系,原核表达cathelicidin家族抗菌肽Lf-CATH2。首先在Lf-CATH2基因上游加入凝血酶位点,并去除p ET32α载体的凝血酶序列和S标签序列,构建优化的Lf-CATH2-p ET32α-TS载体,于大肠杆菌中表达。产物融合蛋白经凝血酶切割释放Lf-CATH2,纯化后进行抗菌活性检测。结果表明改良的硫氧还蛋白融合表达体系显著提高酶切效率达37%,Lf-CATH2在新体系中获得了可溶性高表达,且保留了抗菌活性。因此该新型硫氧还蛋白融合表达体系,有望为cathelicidin家族及其他阳离子活性肽提供更好的原核表达载体工具。     

影响类弹性蛋白多肽自组装成微球的因素及其作用机制

影响类弹性蛋白多肽(ELPs)自组装成微球的因素较多,目前尚缺乏系统研究。以类弹性蛋白多肽[KV8F]n为对象,利用动态光散射仪测定了不同条件下其自组装成微球的粒径。结果表明:随着分子量的增加ELPs形成的微球粒径也随之增大,粒径的均一度减小;当盐浓度低于0.4 mol/L时,盐浓度的增加,微球粒径相应增加,而盐浓度高于0.4 mol/L则呈减少的趋势,但粒径均大于1.1μm;而当ELPs末端融合木聚糖酶和1,3-丙二醇氧化还原酶后,其自组装形成的微球粒径急剧减小,约为游离ELPs的1/10,分别为151.0 nm和174.2 nm。导致这种现象的原因可能是酶分子和ELPs通过静电引力相互作用后,酶分子的空间位阻妨碍了ELPs分子的聚集。     

一株新城疫病毒新强毒株(NL)的分离鉴定及F基因序列测定

１９９６年５月以来,１我国各地鸡群暴发鸡新城疫,其发病特征是常规疫苗免疫无效。为研究此病毒的特征,对从华东某地分离的新城疫病毒毒株（ＮＬ株）进行了生物学研究。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ＮＬ株融合蛋白基因（Ｆ基因）全序列,并测序。结果表明,ＮＬ株平均致鸡胚死亡时间最短的,其尿囊液中病毒滴度可达２＾９,表明病毒繁殖速度快。Ｆ基因测序结果表明,ＮＬ株为一强毒株,与现今国外已发表的ＮＤＶ株Ｆ基因同源性在８     

融合基因umcel5N-CBM的构建、表达及融合酶性质分析

BM,并实现了融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达.研究结果表明,融合酶Umcel5N-CBM与结晶纤维素(avicel)以及滤纸粉末的结合能力比原始酶Umcel5N提高了约一倍,但未显示出降解结晶纤维素的新活性,说明在结晶纤维素的降解过程中,纤维素酶的催化功能域起到关键作用.     

家蚕二分浓核病毒VD1-ORF4基因截短多肽的表达和抗体制备

通过PCR扩增家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)VD1-ORF4基因序列中的两个DNA片段,将测序正确的两个目的片段分别亚克隆到原核表达载体pET-30a上,通过不同浓度的IPTG对含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE和Westen blot分析.结果表明,这两个截短多肽都获得了表达,其N-端融合有6个组氨酸.将割胶纯化的蛋白多肽与佐剂充分研磨,以研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射.获得的抗血清分别对原核诱导表达产物进行Western blot分析,结果表明,在特定的位置都能杂交到一条特异的蛋白带,表明制备的两个多抗能为深入研究VD1-ORF4基因的功能提供基础.     

牛病毒性腹泻病毒Erns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的:利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定.方法:用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用(G4-S)3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-E(MS)-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白.并对表达产物进行鉴定.结果:SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76 800;Westem blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力.结论:BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测.     

cAPK催化亚基的C端融合表达,纯化及其NMT底物活性作用

将小鼠ｃＡＭＰ依赖蛋白激酶催化亚基α（ｍＣα）基因从３＇端截去９６ｂｐ后与Ｈｉｓ－ｔａｇ融合,构建Ｃ端融合Ｈｉｓ６的表达质粒ｐＺＰｍＣα４Ｈ。该质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中得到了高效表达,目的蛋白ｍＣα４Ｈ的表达量与ｍＣα相近。该蛋白在３７℃表达时主要以包含体形式存在,而２２℃表达时则大部分可溶。利用固定化金属离子（Ｎｉ＾２＋）配体亲和层析,分别从破菌上清涂和包含体中纯化ｍＣα４Ｈ,结果表明     

被子植物的无融合生殖

被子植物的无融合生殖孙敬三刘永胜辛化伟（中国科学院植物研究所,北京１０００９３）ＡＰＯＭＩＸＩＳＩＮＡＮＧＩＯＳＰＥＲＭＳＳｕｎＪｉｎｇ－ｓａｎ,ＬｉｕＹｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ,ＸｉｎＨｕａ－ｗｅｉ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｏｔａｎｙ,ＡｃａｄｅｍｉａＳ...     

小鼠脂联素与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

以绿色荧光蛋白(GFP)基因(gfp)为报告基因,构建小鼠脂联素(mADPN)基因(mAd)与gfp的融合基因mAd/gfp表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd-gfp,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达可间接反映mADPN的表达,并通过RT-PCR在核酸水平进一步确证mAd的表达.荧光显微镜观察及RT-PCR结果均证明mADPN在COS-7细胞中获得了高效表达,表明mADPN重组表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd可以在真核细胞COS-7中高效表达mADPN,为进一步探讨mAd在小鼠体内的表达提供了可行性依据.