微生物脂肪酶蛋白质工程*

微生物脂肪酶催化的化学反应具有严格的立体选择性、位点选择性等专一性,催化活性高而副反应少,催化反应不需要辅助因子等特点,因此广泛应用于工农业生产中的诸多领域。利用蛋白质工程技术,提高微生物脂肪酶的特异性、活性和稳定性,对提高微生物脂肪酶制剂产品的市场竞争能力,扩大微生物脂肪酶的应用领域,具有重要的意义。综述了蛋白质工程技术在微生物脂肪酶改性方面的应用现状、存在问题及前景。     

固态发酵生产微生物脂肪酶

脂肪酶在水相和非水相中都具有催化活性,在众多工业领域应用前景十分广阔.但脂肪酶的生产成本仍然过高,限制了其在某些工业领域的大规模使用.固体发酵因具有设备比较简单、能耗低、成本低、对环境危害小、易于推广等诸多优点,已逐渐成为微生物脂肪酶生产的一个重要方式.由于能源成本的抬高和人们环保意识的加强,自上世纪90年代以来,原来一直认为技术含量较低的固态发酵技术重新受到重视并得到了快速的发展.综述了固态发酵在脂肪酶生产中的应用研究,重点介绍了固态发酵生产脂肪酶的特点、脂肪酶固态发酵的影响因素及其生物反应器.     

南极深海沉积物宏基因组DNA中低温脂肪酶基因的克隆、表达及性质分析

从南极普利兹湾深海900米深的沉积物中提取获得宏基因组DNA,并通过设计引物,从中克隆到全长为948bp的低温脂肪酶(lip3)开放阅读框完整序列,该基因编码一个由315个氨基酸残基组成、预计分子质量为34.557ku酶蛋白(Lip3);氨基酸序列上的GFGNS(GXGXS)和G-N-S-M-G(GXSXG)在许多脂肪酶中有很高的保守性,它们是水解机制所必需的序列,也是丝氨酸水解酶中最保守的序列.构建了lip3基因重组表达载体,并在大肠杆菌中获得表达,采用镍离子亲和层析柱对表达的酶蛋白Lip3进行纯化,得到约35ku蛋白条带,酶学性质的分析表明,该酶的最适作用温度为25℃,在0℃时表现为最高活力的22%,最适pH值为8.0,对热敏感,35℃热处理60min剩余酶活为10%,以硝基苯棕榈酸酯为底物,Lip3的酶促反应常数Km值随着反应温度的升高而升高,是典型的低温酶.     

天然多羟基化合物在酶催化下的选择性酯化

综述了近十几年来几种天然多羟基化合物包括皂草苷类、黄酮苷类、生物碱类、甾醇类、倍半萜(烯)化合物、熊果苷和槐糖脂在脂肪酶和枯草杆菌蛋白酶催化下的选择性酯化。     

CGI-58在动物脂类代谢中的作用

细胞中脂滴(Lipid droplets, LDs)表面存在多个调控脂肪储存和分解的蛋白, 这些蛋白对机体的脂肪代谢起着很重要的调控作用。CGI-58(Comparative gene identification-58)分布在LDs表面, 属于α/β水解酶折叠家族, 是脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase, ATGL)和依赖酰基辅酶A溶血磷脂酸酰基转移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAAT)的激活剂。在脂肪分解过程中, CGI-58结合PAT蛋白家族成员之一的脂滴包被蛋白(Perlipin)和ATGL, 促进脂肪分解, 同时CGI-58对ATGL的激活功能受脂滴包被蛋白家族成员间蛋白质与蛋白质相互作用的影响。文章结合国内外研究热点, 针对CGI-58在动物脂类代谢中的作用进行了综述。     

Burkholderia sp.ZYB002中lipA基因的敲除对细胞脂肪酶活性的影响

Burkholderia sp.ZYB002菌株不仅能产生大量的胞外脂肪酶,还能产生大量的细胞结合脂肪酶。对细胞结合脂肪酶的种类进行定性研究,将为开发全细胞脂肪酶催化剂奠定基础。通过分析与Burkholderia sp.ZYB002菌株具有较高同源性的Burkholderia cepacia J2315菌株的脂肪酶基因家族,推测潜在的细胞结合脂肪酶编码基因。通过同源重组插入失活Burkholderia sp.ZYB002菌株的lipA基因,筛选出突变体转化子;测定突变体菌株细胞结合脂肪酶的活性,并与野生型菌株比较。试验结果表明,lipA基因插入失活的Burkholderia sp.ZYB002-ΔlipA菌株的细胞结合脂肪酶活性降低了42%。     

脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达及表达产物性质的研究

从环境中筛选到了脂肪酶高产菌株金黄色葡萄球菌JH,依据NCBI上发表的原核微生物脂肪酶基因序列的多序列比对,发现它具有很强的序列保守性。利用PCR从金黄色葡萄球菌JH基因组中扩增得到了脂肪酶基因,利用基因重组技术将其整合到质粒pC194中,并导入到枯草芽孢杆菌中进行表达。应用选择抗药性筛选重组子,利用硫酸铵沉淀法和离子交换层析分离纯化重组脂肪酶,并用DS-PAGE进行纯度鉴定,确定其相对分子量约为32000Da。通过对其酶学特性的研究发现,重组脂肪酶在反应温度为41℃, pH为8.0时具有最大活性,其Km和Vm各自为0.34mM和308μmol•mg-1min-1,Ca2+、K+、Mg2+能激活这种酶的活性鳩e2+、Cu2+、Co2+则抑制它的活性。     

K202A突变对扩展青霉脂肪酶热稳定性的影响

利用易错PCR定向进化扩展青霉脂肪酶（PEL）,获得了一株热稳定性有所提高的随机突变体（ep8）,ep8包含有一个氨基酸的改变。为进一步提高其热稳定性,作者利用重叠延伸PCR法,以ep8基因为模板,将第202位赖氨酸突变为丙氨酸（K202A）,构建表达质粒pAO815-ep8-K202A。并将其引入毕赤酵母GS115构建叠加突变体(PEL-ep8-K202A)。同时以野生型lip07为模板构建单点突变体:PEL-lip07-K202A。15% SDS-PAGE 结果分析表明突变体分子量与野生型一致,约为28KD. 表达产物热稳定性分析结果表明: 野生型（PEL）的Tm值为39.03℃,而以野生型为模板进行定点突变得到的单点突变酶（PEL-lip07-K202A）,其Tm却降低了2℃,为37.08℃。叠加突变酶(PEL-ep8-K202A)的Tm为41.66℃, 比野生型酶提高2.63℃,比随机突变体ep8生产的酶（PEL-ep8）的Tm提高了1.21℃。     

链霉菌Z94-2碱性脂肪酶产生条件及酶学性质

在１５２株脂肪酶产生菌中,链霉菌Ｚ９４－２产脂肪酶活力为５９６ｕ／ｍＬ,其最适培养基（ｇ／Ｌ）为：糊精１０、黄豆饼粉３０、尿素１０、Ｋ２ＨＰＯ４０．５、ＭｇＳＯ４０．５、ＮａＣｌ１和ＡＥＯ９０．５,产酶的最适条件为：初始ｐＨ９．５～１０．０,在２６℃培养４８ｈ。用ＰＶＡ橄榄油乳化系统测定该酶的最适ｐＨ９．８,最适温度３７℃,在ｐＨ８．６～１０．２于５℃存放２４ｈ,酶活力不变。０．１４ｍｏｌ／Ｌ的氯     

链霉菌Z94-2碱性脂肪酶产生条件及酶学性质

在１５２ 株脂肪酶产生菌中,链霉菌Ｚ９４２ 产脂肪酶活力为５９６ｕ／ ｍＬ,其最适培养基（ｇ／Ｌ） 为：糊精１０ 、黄豆饼粉３０ 、尿素１０ 、Ｋ２ＨＰＯ４ ０－５ 、ＭｇＳＯ４ ０－５ 、ＮａＣｌ １ 和ＡＥＯ９ ０ ．５ ,产酶的最适条件为：初始ｐＨ９ ．５ ～１０－０ ,在２６ ℃培养４８ｈ 。用ＰＶＡ 橄榄油乳化系统测定该酶的最适ｐＨ９ ．８ ,最适温度３７ ℃,在ｐＨ８－６ ～１０－２ 于５ ℃存放２４ ｈ ,酶活力不变。０－１４ｍｏｌ／Ｌ 的氯化钙有较大的激活作用。