基于多重计算设计策略提高奇异变形杆菌脂肪酶的热稳定性

来自奇异变形杆菌的脂肪酶(Proteus mirabilis lipase,PML)具有较好的有机溶剂耐受性,在生产生物柴油等领域有广泛的应用潜力.然而,其热稳定性仍有待提高以更好地适应工业生产.近年来,基于计算机辅助的多种计算设计策略的发展为酶的热稳定性改造提供了更多的思路.文中首先选择了 3种基于互补算法的软件AB...     

脂肪酶产生菌Candida rugosa产酶条件研究

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是用来催化酯类化合物的分解、合成和酯交换的特殊酶,具有高度的化学选择性和立体异构性,它广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域.本世纪80年代,美国科学家发现酶在近无水的有机溶剂中不仅能保存其催化活力,而且还获得许多新的催化特征[1],此后,脂肪酶在非水相酶催化领域的研究和应用逐渐增多.     

假单胞菌属脂肪酶的分子生物学研究进展

微生物脂肪酶是商品化脂肪酶的主要来源,并广泛应用于诸多工业领域。与其他微生物脂肪酶相比,细菌脂肪酶催化反应的类型更多、活性更高、稳定性更好,其中又以假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶的性能最为优越。作为性能最为优越、应用最为广泛的一类脂肪酶,假单胞菌属脂肪酶研究一直是脂肪酶领域的热点。就假单胞菌属脂肪酶的分子生物学研究进展进行归纳和述评,包括基因资源挖掘及克隆、基因表达调控及分泌机制、活性过表达策略、蛋白质结晶及3D结构解析、蛋白质工程,并对其未来研究方向做出展望,以期为后续研究提供有益参考。     

产脂肪酶黑曲霉摇瓶发酵条件优化研究北大核心CSCD

黑曲霉Aspergillus niger G62s是一株具有遗传稳定的高产脂肪酶菌株。针对于G62s摇瓶发酵条件进行统计学优化研究,以提高该菌株的产脂肪酶能力。首先,采用单因素方法对发酵接种量、摇瓶装量、培养温度、培养时间等因素进行考查,在此基础上进行4因素3水平的响应面分析(Response surface methodology,RSM)的统计学优化。得到的优化发酵条件是接种量1.9%,摇瓶装量56 m L(500 m L摇瓶),培养温度30 oC,培养时间75 h。在该优化条件下,脂肪酶活性达到(212 9±39.9)U/m L,相比初始的发酵条件提高16.7%。针对于影响G62s菌株产脂肪酶的4个发酵条件,在单因素实验的基础上通过RSM方法优化,显著提高了目标菌株脂肪酶产量。     

低温脂肪酶的产酶条件优化及其酶学性质

利用单因素筛选和正交试验对Burkholderia sp. SYBC LIP-Y发酵产酶的液体培养基和发酵条件进行了优化,其优化配方为：可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏15 g/L、NaNO3 0.252 g/L、橄榄油40ml/L、Triton x-100 10ml/L、初始pH 7.5、接种量10%(V/V),脂肪酶酶活达到85.23U/ml,是优化前的3.63倍。通过对双水相纯化得到的脂肪酶进行酶学性质研究,确定该酶反应的最适pH为10.0,最适温度为30℃,40℃下保温60min酶活性还有80%以上,该脂肪酶为低温脂肪酶,热稳定性好,具有一定的耐醇性,应用前景广阔。     

拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

荧光标记脂肪酶的固定化及其稳定性

将标记有荧光探针FITC(异硫氰基荧光素)的脂肪酶固定化,通过测定活性和荧光光谱,探究各种因素对固定化后荧光标记脂肪酶性质的影响,并分析活性、构象和荧光光谱三者之间的联系。研究结果表明:在固定化脂肪酶过程中,聚乙二醇400二丙烯酸酯能形成合理的网格结构,使酶活较高;配体诱导酶的催化构象,使酶活性提高到未诱导酶的2倍以上;配体抽提能使脂肪酶活性中心得到释放从而提高催化活力。固定化脂肪酶的稳定性大大提高,在90℃、强酸强碱下固定化酶仍保有原酶70%、60%以上的活性;用盐酸胍、脲等溶解变性剂浸泡15d后,酶活性仍然可以保持初始活性的70%以上。荧光光谱能较好地反映脂肪酶的活性和构象变化,最适pH和温度下脂肪酶的荧光强度最低,在溶解变性剂中,荧光强度随时间延长而逐渐降低,这表明不同条件下脂肪酶构象经历的去折叠过程不同。     

激素敏感性脂肪酶HSL对生殖系统的整合调控

激素敏感性脂肪酶被认为是经典的脂肪分解限速酶,可特异水解甘油三酯,受儿茶酚胺等激素调控。近年来研究表明:HSL作用底物不仅有甘油三酯,还包括甘油二酯、甘油一酯、胆固醇酯等。然而,脂肪酶在生殖系统的功能并不清楚,基因敲除小鼠为证实HSL广泛存在于生殖系统提供良好模型,提示其可能在生殖系统生理及病理生理过程发挥重要调节作用,本文将着重介绍生殖系统中HSL基因与蛋白质结构并总结其在生殖系统的功能。     

人参皂苷Rb3对胰脂肪酶的抑制作用

采用硅胶柱层析、JTY树脂分离制备人参皂苷Rb3,薄层板(TLC)跟踪,高效液相色谱法(HPLC)检测。目的是研究西洋参叶中不同浓度的人参皂苷Rb3对胰脂肪酶的抑制作用影响,从而表明人参皂苷Rb3在抗肥胖中的作用。用制得的人参皂苷Rb3,在卵磷脂所乳化的甘油三酯的检测系统中进行体外胰脂肪酶抑制实验。结果表明:制得的人参皂苷Rb3经过三种不同展开剂,薄层板展开,均为一个点,进一步经HPLC检测其纯度为93.2%。胰脂肪酶抑制试验结果表明人参皂苷Rb3在浓度为0～1 mg/mL时,其抑制率达到85.11±0.409%,而且远远高于西洋参叶提取物。本文通过胰脂肪酶抑制试验表明Rb3具有抗肥胖作用,其抑制机制有待进一步研究。     

寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析

根据寄生曲霉脂肪酶基因序列(GenBank登录号:AF404488)及大肠杆菌密码子的偏爱性,应用重叠延伸PCR技术,人工合成了寄生曲霉脂肪酶基因lipAP.将基因克隆到pFL-B13cl载体上获得重组质粒pFL-B13cl/Lip AP,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达.融合蛋白Sumo-LipAP在0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导6 h表达量最高.SDS-PAGE分析显示融合蛋白His-Sumo-LipAP以包涵体形式表达,大小约为53 kD.复性后透析处理,大部分融合蛋白转化为正确构象且具有催化活性,经一步疏水层析其纯度可达98％.生物信息学工具预测和分析发现,LipAP空间结构保守,具有催化三联体(Ser173-Asp226-His288)、活性部位盖子(S111YSIRNWVTDAT122)及保守五肽(GHSLG)3个功能域.