来源于青霉XMZ-9两个低温脂肪酶的基因克隆、原核表达与性质测定

低温脂肪酶在低温条件下仍具有较高活性,在食品添加剂、洗涤添加剂及有机合成等产业具有非常独特的应用前景。从低温菌株中分离低温脂肪酶基因是开发新的低温脂肪酶的有效手段。首先利用油脂同化平板与三丁酸甘油酯-维多利亚蓝平板从冰川土样中筛选分离获得一株具有较高脂肪酶活性的真菌,18S rDNA鉴定其属于青霉属,命名为Penicillium sp.XMZ-9。根据真菌脂肪酶多序列比对获得的保守区,设计简并引物,利用降落PCR与染色体步移的方法从Penicillium sp.XMZ-9中克隆到2个完整的脂肪酶基因,分别记为LipA与LipB。LipA全长1 014 bp,无内含子,编码337个氨基酸。而LipB全长1 232 bp,cDNA长1 122 bp,含有2个内含子,编码373个氨基酸。将两基因的cDNA序列克隆到pET30a(+)载体上,转化大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)。经低温诱导表达后,LipA大部分表达为包涵体,包涵体经复性后具有脂肪酶活性,并表现出低温适应性;LipB则大部分表达为可溶性蛋白,Ni-亲和层析柱纯化后,其亦具有低温脂肪酶活性。青霉菌株XMZ-9的获得与低温脂肪酶的克隆表达研究,为研究低温菌株与低温酶的适冷机制提供了宝贵的资源,也为进一步开发利用低温脂肪酶奠定了基础。     

匙吻鲟仔稚鱼消化酶发育的研究

对出膜后0—53d匙吻鲟的酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶以及磷酸酶的活性变化进行了测定。匙吻鲟出膜后饲养于室内水泥培育池中,从第3天开始投喂枝角类,之后于第40天将试验鱼转移至池塘。试验材料为受精卵及出膜后第3、第6、第12、第20、第30、第40、第44、第47、第53天仔稚鱼样品。研究发现主要消化酶在出膜时或卵黄期即可检测出活力。碱性蛋白酶和酸性蛋白酶分别在出膜后3d(3DAH)和刚出膜时(0DAH)检测出活力。碱性蛋白酶活力在44DAH达到最大值[(1.96±0.09)U/fish],47DAH出现下降,但在53DAH开始上升,比活力在53DAH达到最大值[(8.84±0.59)U/mg protein]。酸性蛋白酶在44DAH达到最大值[(0.52±0.05)U/fish],比活力在6DAH出现第一个峰值[(2.08±0.09)U/mg protein],并在30DAH出现最小值[(0.83±0.06)U/mg protein]。试验期间碱性蛋白酶活力高于酸性蛋白酶。在12DAH—40DAH期间α-淀粉酶活力相对稳定,并在47DAH达到最大值[(0.42±0.03)U/fish],比活力在12DAH出现一个峰值[(1.18±0.12)U/mg protein],并于47DAH出现最大值[(1.94±0.16)U/mg protein]。发育早期脂肪酶活力较高,活力和比活力分别在30DAH[(0.20±0.02)U/fish]和6DAH[(2.28±0.22)U/mg protein]出现最大值。碱性磷酸酶活力变化趋势与比活力变化趋势相似,但是最大值分别出现在44DAH[(0.08±0.00)U/fish]和30DAH[(1.96±0.15)U/mg protein]。酸性磷酸酶活力在3DAH出现一个峰值[(0.01±0.00)U/fish],之后显著升高,并在44DAH达到最大值[(0.05±0.00)U/fish],其比活分别在30DAH[(1.19±0.10)U/mg protein]和44DAH[(1.10±0.08)U/mg protein]出现两个峰值。结果表明,蛋白酶、α-淀粉酶和磷酸酶随个体发育活力增加,碱性蛋白酶在个体发育早期对蛋白质的消化具有重要作用。养殖环境发生改变时,酸性蛋白酶、α-淀粉酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活力在生长减慢时增加,生长加快时降低,而脂肪酶活力则维持稳定。     

黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶的纯化及性质分析

从黑曲霉发酵液中经硫酸铵分级沉淀,Phenyl-Sepharose疏水柱层析,DEAE-Sepharose 4B阴离子交换柱得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数达10倍,回收率50％。对脂肪酶的性质分析表明：该酶分子质量约为35kDa,最适温度和最适pH分别为37℃和9．5,50℃以下和pH6．0～11．0之间保持稳定,属于碱性脂肪酶。Mg^2＋、Ca^2＋、Cu^2＋、Zn^2＋、Co^2＋、Mn2^＋对该酶有激活作用,而Al^3＋、Fe^2＋、Fe^3＋对酶有严重抑制作用。变性剂盐酸胍和脲对其未见显著影响,而SDS强烈抑制其酶活。用不同氨基酸修饰剂对酶进行修饰,其中NBS和PMSF强烈抑制该酶活性,NBSF和DTT在低浓度下对酶活影响不大,2,3-丁二酮在高浓度下影响其活性。外加稳定剂如NaCl、PEG、甘油、山梨醇、海藻酸钠,均可不同程度的延长脂肪酶的半衰期。在一定质量比条件下,该酶有良好的抗蛋白酶性质。     

毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B全细胞催化合成葡萄糖月桂酸酯

利用表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的毕赤酵母细胞为全细胞催化剂,以葡萄糖为酰基受体,月桂酸为酰基供体,在非水相体系中催化合成糖酯。用硅胶柱层析对产物进行初提,再用制备液相色谱进一步分离纯化,并用高效液相色谱-质谱鉴定纯品性质。对该酶法合成糖脂反应体系进行了优化,其中考察了有机溶剂种类、复合溶剂体系中二甲基亚砜(DMSO)体积百分比、酶量、底物摩尔比、水活度和温度等几个影响酯化反应的因素。结果表明:在5mL反应体系中,以叔戊醇/二甲基亚砜(DMSO30%,V/V)为反应介质,添加初始水活度为0.11的全细胞催化剂0.5g,葡萄糖0.5mmol/L,月桂酸1.0mmol/L,60°C下反应72h后,葡萄糖月桂酸单酯的转化率达到48.7%。     

基于核糖体基因序列快速鉴定产脂肪酶微生物

利用含罗丹明B的橄榄油检测平板从中国各省市油污土壤中分离、筛选产脂肪酶微生物菌株,扩增细菌的核糖体基因16S rDNA序列和真菌的ITS2序列,分析核糖体基因簇DNA,并结合形态学特征从而对产脂肪酶菌株进行分子生物学鉴定.核糖体基因16S rDNA序列分析及系统发育分析表明,分离得到的产脂肪酶细菌分别属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱伯克霍尔德氏(Burkholderia cepacia)、琼氏不动杆菌(Acinetobater jurii)、嗜麦芽窄食单孢菌(Stenotrophomonas maltophilia)和荧光假单胞菌(Pseudomonas sp.);真菌核糖体基因转录间隔区(ITS2)序列及同源性分析表明产脂肪酶真菌分别属于黑曲酶(Aspergillus niger)、白地酶(Galactomyces geotrichum)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、丝孢酵母(Trichosporon guehoae)和假丝酵母(Candida sp.).研究结果表明,核糖体基因簇的DNA分析技术为从自然界分离、鉴定产脂肪酶菌种提供了一种快速有效的手段,为产脂肪酶微生物资源开发利用奠定了技术基础.     

黑曲霉脂肪酶分子结构预测

根据克隆到的黑曲霉脂肪酶基因序列,概念性翻译出其编码的氨基酸序列.利用BioEdit、PSIPRED和SwissModel等软件及服务器对黑曲霉脂肪酶的一级结构、二级结构和三级结构进行分子结构模型的预测与模拟.预测结果显示,黑曲霉脂肪酶分子的一级结构、二级结构及三级结构的结构特点与丝氨酸水解酶高度吻合.预测的黑曲霉脂肪酶各种二级结构成分含量与实际测定的重组黑曲霉脂肪酶二级结构成分相符.在三级结构水平上,黑曲霉脂肪酶"盖子"结构域所在的位置与已解析的黑曲霉阿魏酸酯酶对应结构域所在的位置存在显著差异.盖子结构域位置的差异预示一种开盖型脂肪酶分子设计和构建的可能.     

斜带石斑鱼2种胰脂肪酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝胰脏中胆盐活化的胰脂肪酶(bile salt-activated lipase,BSAL)和依赖于辅酶的胰脂肪酶(colipase-dependent pancreatic lipase,PL)基因的全长cDNA序列.BSAL基因全长cDNA序列1 796 bp,编码558个氨基酸,该蛋白序列含有BSAL的全部特征结构区,与其他脊椎动物BSAL的氨基酸序列同源性为49.9%～57.3%.PL基因的全长cDNA序列1 503bp,编码465个氨基酸,该蛋白序列含有PL全部的特征结构区,与其它脊椎动物PL的氨基酸同源性为49.1%～73.9%.系统树分析表明,斜带石斑鱼BSAL和PL与其它物种BSAL、PL和胰脂肪酶相关蛋白(PL-RP)聚于进化树的两个不同分支,属于2种不同的胰脂肪酶.结果证实,在同一鱼类体内也存在BSAL和PL两种胰脂肪酶基因.     

固态发酵生产微生物脂肪酶的研究进展

脂肪酶在水相和非水相中都具有催化活性,在众多工业领域应用前景十分广阔。但脂肪酶的生产成本仍然过高,限制了其在某些工业领域的大规模使用。固体发酵因具有设备比较简单、能耗低、成本低、对环境危害小、易于推广等诸多优点,已逐渐成为微生物脂肪酶生产的一个重要方式。由于能源成本的抬高和人们环保意识的加强,自上世纪90年代以来,原来一直认为技术含量较低的固态发酵技术重新受到重视并得到了快速的发展。综述了固态发酵在脂肪酶生产中的应用研究,重点介绍了固态发酵生产脂肪酶的特点、脂肪酶固态发酵的影响因素及其生物反应器。     

基于响应面设计脂肪酶Novo435催化合成甘油二酯的工艺优化

以甘油、油酸为原料,优化在无溶剂体系中以固定化脂肪酶Novo435催化合成甘油二酯（diglyceride,DAG）的工艺。系统考察底物摩尔比（油酸／甘油）、反应温度、时间和加酶量等因素对油酸转化率和甘油二酯含量影响的基础上,利用响应面试验设计优化各主效因子,并经回归分析获得最优的工艺条件。所得最优条件：油酸与甘油底物摩尔比2．27、反应温度48．14℃、反应时间6．3h、加酶量1．68％。在此条件下,实验测得油酸转化率为45．42％,甘油二酯质量分数为70．01％,与响应面模型预测值吻合。     

大麦脂肪酶的研究进展

脂肪酶以其独特的优势在各个领域都有其潜在的应用前景。在高等植物中,种子萌发过程中脂肪酶活性较高,其活性与食品的加工方法有关。应用不同的方法测定大麦脂肪酶酶活力,得到的结果也不同。详细介绍了大麦脂肪酶的部分酶学性质。