一株节杆菌发酵产物中类胡萝卜素的分离及组分分析的初探

【目的】对实验室保存的一株红色球菌进行菌株鉴定,并对色素提取液的组分进行定性分析。【方法】采取形态学观察、16S rDNA序列同源性分析和生理生化分析相结合的方法确定菌株的分类地位。使用乙醇-丙酮混合液提取胞内色素,采用硅胶G薄板层析法对色素提取液进行初步分离纯化,并结合其光谱吸收特性、质谱结果进行定性分析。【结果】实验结果表明此菌株属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)。薄板层析结果显示该菌株内主要有4种色素组分,且靠近溶剂前沿组分为黄色,其它组分皆为橘红色。吸收光谱特性、质谱结果显示黄色组分可能为β-胡萝卜素,橘红色组分可能为螺菌黄质系类胡萝卜素。【结论】此株节杆菌以较为廉价的糖蜜和玉米浆作为营养物质用于满足自身生长需要,并且积累胞内类胡萝卜素,因此该菌的进一步研究有一定的价值。     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。     

利用发酵促进剂提高红酵母β-胡萝卜素产率

为提高红酵母生物合成β-胡萝卜素的产量,分别研究了几种添加物对发酵过程的促进效应。试验结果表明：分别添加硫胺素、核黄素、大豆油和番茄汁可以显著促进红酵母合成β-胡萝卜素。当按单因素试验确定的最优添加量联合添加硫胺素1.5mg/L、核黄素3mg/L、大豆油5mg/L、番茄汁6mg/L时,试验证实β-胡萝卜素发酵产率可比对照提高80%以上,值得进一步研究。     

螺旋藻中β-胡萝卜素高效液相色谱测定方法的研究

采用高效液相色谱法直接测定螺旋藻中β-胡萝卜素组分的含量.色谱柱为YMC-pack ODS(4.6mm i.dx 150 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-二氯甲烷(体积比60:30:10),在435nm波长处检测.研究结果表明:β-胡萝卜素的检测限为20ng,线性范围在4.60～36.80 mg/L,相关系数为0.9996,加样平均回收率为96.61%.方法准确、简便、快速,适用于螺旋藻及螺旋藻制品中β-胡萝卜素组分的检测.     

红酵母细胞中β-胡萝卜素的快速分离柱高效液相色谱法测定

研究了用快速分离柱高效液相色谱法测定红酵母细胞中β-胡萝卜素的方法。发酵法得到的样品经匀浆后用四氢呋喃提取,提取液以ZORBAXStableBound(4.6×50mm,1.8μm)C18快速分离柱为固定相,乙腈-四氢呋喃体积比8020为流动相分离,流速为1.5ml/min;在该色谱条件下,β-胡萝卜素在1.0min内可达到基线分离;用紫外二极管矩阵检测器检测。方法标准回收率为98%～103%,相对标准偏差为0.46%～0.58%,可用于几种发酵样品中β-胡萝卜素的测定,结果可靠。     

菌株HYR-08色素的提取与鉴定的初步研究

目的:探讨菌株HYR-08分泌的生物活性物质-色素的成分及应用.方法:收集刚进入生长平稳期的菌株,采用丙酮-石油醚萃取法提取其色素并用0.22μm无菌滤膜纯化色素粗产品.用高效液湘色谱反相C18柱、740-FTIR傅里叶变换红外光谱仪与UV型紫外吸收光谱仪对色素样品进行分离与鉴定.用灌胃和腹腔注射两种方法检测色素对昆明小鼠的毒性.结果: UV全波段扫描结果发现在448 nm、462 nm和484nm处有3个明显的类胡萝卜素吸收峰,其中以448 nm峰最为明显.红外光谱检测发现在3027 cm'、2950 cm'、2858 cm'、1722 cm'、1649 cm'、1442 cm'和965cm'处有明显的β-胡萝卜素吸收峰.反相C18柱分离结果亦发现色素粗产品含有明显的β-胡萝卜素的特征峰.毒理实验结果发现该色素对昆明小鼠腹腔注射与口服的最小致死剂量成年鼠分别为:728.26mg/kg与2800mg/kg;幼年鼠分别为:589.65mg/kg与2489mg/kg.结论:菌株HYR-08分泌的色素主要成分为β-胡萝卜素,且毒性低.     

通过番茄红素环化酶的优化构建β-胡萝卜素高产菌株

目标产物的合成途径往往需要对关键酶的来源、表达水平等因素进行系统性优化才能实现代谢通量的最大化。β-胡萝卜素是一类具有重要应用价值的萜类化合物,其中番茄红素环化酶(Lycopene cyclase,CrtY)是β-胡萝卜素合成途径中的关键酶,能够催化FAD依赖的环化反应将番茄红素转化合成β-胡萝卜素。本研究通过对CrtY的系统优化提高β-胡萝卜素的合成水平,并确定CrtY的表达对代谢通路的影响。在大肠杆菌中以番茄红素合成模块为基础,通过引入番茄红素环化酶基因crt Y构建了β-胡萝卜素合成模块。并进一步利用寡聚接头介导的DNA组装方法 (Oligo-linker mediated assembly method,OLMA)引入一系列不同强度的人工设计的核糖体结合位点(Ribosome-binding site,RBS),对CrtY的表达强度、基因来源等因素进行高通量的优化。通过OLMA文库构建和平板筛选,获得了5株高产β-胡萝卜素的工程菌株。在摇瓶中,5株工程菌株的β-胡萝卜素产量可达15.79-18.90 mg/g DCW(Dry cell weight),比优化前提高了65%。进一步选取了其中的CP12菌株,在5 L发酵罐上,利用高密度培养技术验证工程菌株合成β-胡萝卜素的能力。最终β-胡萝卜素产量可达1.9 g/L。RBS强度分析及代谢中间体分析表明,适当地降低CrtY表达强度能够有利于β-胡萝卜素模块相关基因之间协同发挥作用。以上结果为β-胡萝卜素合成途径的优化规律提供了理论指导。     

提高红酵母胡萝卜素发酵产率的研究

以红酵母RY-998为实验菌株,采用液体摇瓶发酵方式,在培养基中加入氟化铵等6种添加物,研究它们对红酵母和长及胡萝卜素合成的影响。结果表明;除植酸和二甲基亚砜外,氟化铵,醋酸铵,L-亮氨酸和L-缬氨酸对红酵母胡萝卜素产率均有明显的提高作用;当同时添加氟化铵15mg/L,醋酸铵20mg/L,L-亮氨酸40mg/L和L-缬氨酸30mg/L时,细胞生物量,胡萝卜素含量和产率可分别比对照组提高42.2%,55.4%和121.2%。     

冷冻贮藏对西瓜组织中番茄红素稳定性的影响

Joumal of Agricultural and Food Chemistry 2003年51卷12期3582～3586页报道：番茄红素是一种类胡萝卜素，也是β-胡萝卜素的前体，但其抗氧化能力至少相当于β-胡萝卜素的两倍。一系列的流行病学研究证明，食用高番茄红素的食品可有益于健康。     

盐藻与β—胡萝卜素

微藻生物技术是近年来新兴的生物技术之一,至今有三种微藻已大规模生产,包括小球藻、螺旋藻与盐生杜氏藻(简称盐藻)。由于盐藻能生产出干重高达10％的β-胡萝卜素,现已成为微藻中占有最大市场的种类。关于盐藻养殖生物学、盐藻β-胡萝卜素的生产及应用,已成为各国科学家研究的焦点。1983年召开的第十一届国际海藻会议将盐藻及β-胡萝卜素列入大会的专题讨论,1990年世界营养学会的主题是β-胡萝卜素,1991年美联社将β-胡萝卜素的作用选为世界十大科技新成就之一。