未成熟杏胚离体培养

ImmatureEmbryoCultureofApricotinvitroWANGYuZhu,SHIHons（PomologyandForestInstitute,AgricultureandForestryScienceAcademyofBeijing,Beijing100093）1植物名称杏（Prunusarmeniaca）极早熟品种“骆驼黄”。2材料类别盛花后41、46和57d的未成熟胚。3培养条件培养基为Tukey、SH、Norstog［KNO3160mg／L（单位下同）,Ca（NO3a）2·4H2O290,NaH2PO4·H2O800,Na2SO4200,MgSO4·7H2O730,KCl140,FeC6H5O7（1％）10,H3BO30.5,CuSO4·5H2O0．25,MnSO4·4H2O3,ZnSO4·7H2O0．5,Na2MoO4·2H2O0．…     

TGFβ1真核表达载体对^60Coγ射线照射的人胚肺成纤维细胞的稳定转染方法研究

选择^60Coγ射线5Gy照射后第7天的人胚肺成纤维细胞（HELF）,采用聚阳离子脂质体LipofectAMINE介导的基因转染法将人TGFβ1正、反义基因表达载体pMAMneo-TGFβ1和pMAMeno-AntiTGFβ1转入HELF,转染细胞经G418抗性筛选出来。提取培养细胞的染色体DNA,用DAN斑点印迹分析表明,它们能与neo基因特异杂交。用neo基因特异的PCR引物能从转染细胞扩增出276bp的阳性片段,而未转染细胞则扩增阴性。     

红腹罗非鱼视网膜色素上皮及光感器的胚后分化

硬骨鱼胚后发育中,边缘生长区及胚胎裂缝代表神经形成的活跃位点,同时对新的神经胶质细胞和光感器(视锥和视杆细胞)的形成有积极作用。此项工作首次研究红腹罗非鱼(硬骨鱼类辐鳍亚纲)视网膜中视网膜色素上皮和光感器的胚后生长及分化。采用光学和透射电子显微镜术分析了四个大小不同的鱼群组。正如至目前为止,在已研究过的大多数其它硬骨鱼中所观察到的结果一样,我们研究的所有样本中,成年红腹罗非鱼的视网膜表现为气球样扩张。此外,尚具有一弯曲的、有开口的胚胎裂缝,表明眼的不对称性胚后生长。在胚后分化过程中,视网膜色素上皮表现为自外周向中央的梯度变化,即边缘生长区周围,该上皮仅含有球形的黑色素体,而在中央部位发育为长形的黑色素体及顶端突起。同样,发育中的光感受器亦表现为由侧面向中央逐步发展变化的程序。光感觉器先形成1内节及其附属的突起,随后内节分化为一椭圆体加一肌样结构,这两种成分与其它已研究过的硬骨鱼视网膜中观察到的胚胎发育程序大致相符。因此提供了另一线索：硬骨鱼胚后视网膜的生长极大地刺激(促进)了胚胎视网膜的发育。本研究表明：双体视锥细胞可能是发育中的单体视锥细胞裂开的结果[动物学报49(6)：813～818,2003]。     

ABA、NAA诱导水稻胚性愈伤组织的研究

ABA和NAA联合使用能有效地诱导水稻原生质体再生的愈伤组织向胚性发展。通过液体浅层培养由原生质体得到的愈伤组织,在含ABA和NAA的N_6培养基上培养一段时间,可以诱导原来呈非胚性状态的愈伤组织形成胚性愈伤组织,并在含ZT的N_6分化陪养基上产生绿点。通过对这两种愈伤组织的生化分析,表明二者在游离氨基酸、DNA、RNA、核酸及蛋白质含量等方面,特别是SDS-PAGE谱带存在明显的差异,其细胞的形态与结构也有显著差别,其中经ABA NAA诱导后的愈伤组织其细胞形态与结构特征与来源于种胚的胚性愈伤组织基本类似,所分析的生化指标也大多数相近。结果表明,ABA和NAA联合使用得当,能促进形成胚性愈伤组织。     

H1N1流感病毒血凝素对人肺细胞的损伤作用及机制研究

目的:研究H1N1流感病毒血凝素HA对人胚肺成纤维细胞的损伤作用并初步探讨其机理。方法:合成2009 H1N1的HA基因全长,分别将HA的PCR产物和pEGFP-N1质粒经Hind Ⅲ和EcoRI酶切电泳、纯化、连接并转化大肠杆菌DH5α,构建真核表达质粒pEGFP-N1/HA。质粒转染293细胞,检测其转染效率,并收获细胞总蛋白进行Western blotting检测。将阳性质粒转染MRC-5细胞,CCK-8检测HA的表达对细胞增殖活性,线粒体膜电位检测试剂盒检测其对细胞的早期凋亡的影响,ATP检测试剂盒检测HA的表达对ATP水平的改变。结果:PCR电泳检测获得分子量为1700 bp左右的目的条带,菌落PCR鉴定HA片段成功插入pEGFP-N1载体。荧光显微镜下检测pEGFP-N1/HA转染293细胞有明显荧光,Western blotting结果显示pEGFP-N1/HA转染细胞有单一的目的蛋白表达。HA的表达可明显抑制MRC-5细胞活力,HA的高表达降低MRC-5细胞的线粒体膜电位及ATP水平。结论:H1N1流感病毒HA对人肺细胞的损伤作用可能与影响肺细胞的线粒体功能有关。     

基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化、纯化和检测方法

目的:建立并优化基于Avi-tag标签技术的人胚肾细胞增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的定点生物素化标记、纯化和检测方法。方法:分别构建具有Avi-tag标签的eGFP真核表达载体plenti-Avi-eGFP和BirA酶真核过表达载体pQCXIH-BirA,将plenti-Avi-eGFP和pQCXIH-BirA共转染人胚肾293T细胞,12 h后观察Avi-tag标签对eGFP蛋白在细胞内定位的影响;48 h后裂解细胞,用链霉亲和素珠子纯化生物素标记的eGFP,SDS-PAGE观察eGFP纯化和富集情况,并优化基于Western印迹的生物素化eGFP检测方法。结果:Avi-tag标签对eGFP在细胞内的定位无影响,同时BirA酶在293T细胞内可将带Avi-tag标签的eGFP标记上生物素;生物素化的eGFP可特异性地被链霉亲和素珠子纯化和富集,纯度可达95%;Western印迹检测生物素化蛋白的最终条件为5%的BSA作为封闭液和终浓度为100 ng/mL的链霉亲和素-HRP。结论:建立了基于Avi-tag技术的人胚肾细胞内增强型绿色荧光蛋白的生物素化标记、纯化与检测方法,为该方法的广泛应用奠定了前期技术基础。     

马尾松幼胚体细胞胚胎发生研究

本论文首次报道了马尾松（Pinus massoniana Lamb.）幼胚体细胞胚胎发生的完整发育过程,并对影响马尾松胚性愈伤组织诱导的因素如球果采种期、球果冷藏处理时间、外植体处理方式等进行了探讨,统计胚性愈伤组织诱导率,进行增殖评价,探讨ABA浓度梯度对马尾松体细胞胚分化成熟的影响,试验数据用SPSS16统计分析软件进行方差分析、差异显著性检验。结果表明：1）2008~2009连续2年内15个采种期得到的幼胚,胚性愈伤组织诱导和增殖有显著性差异,最适宜的马尾松球果采种期是6月下旬至7月下旬,诱导率在9.66%~22.59%之间;2）球果冷藏处理时间,对胚性愈伤组织诱导有显著性差异,其中4℃冷藏球果15d有利于幼胚胚性愈伤组织诱导;3）雌配子体包含幼胚的接种处理方式是可取的;4）胚性愈伤组织经稳定增殖培养后,转入分化成熟培养基,得到体细胞胚状体＂爆发式＂分化成熟,数量多,质量好。适宜体胚成熟转化的培养基为：成熟LP培养基添加ABA5.0mg·L-1＋60.0g·L-1蔗糖,并附加L-谷氨酰胺和水解酪蛋白;5）成熟体细胞胚在无激素萌发型LP培养基上正常萌发,并转化为结构完整的小植株。本研究首次建立了马尾松幼胚体细胞胚胎发生技术平台,为马尾松遗传改良种质创新、缩短育种周期奠定了研究基础。     

瓦氏黄颡鱼的胚后发育观察

2002年5~6月,在四川省泸州市、合江县分数批收集到长江野生瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)亲本,通过人工催产、人工授精获得受精卵,对其胚后发育过程进行了观察。瓦氏黄颡鱼的胚后发育过程可以分为卵黄囊仔鱼、晚期仔鱼和幼鱼3个阶段。初孵仔鱼淡黄色,肌节40对,平均全长5.2mm。水温20~22℃时,孵出后第3d口张开;第7d开始摄食;第9d卵黄吸尽,此时鱼苗平均全长12mm,卵黄囊仔鱼阶段结束。晚期仔鱼阶段的仔鱼,胸鳍、尾鳍、臀鳍、背鳍、腹鳍先后发育,至鳍褶消失时晚期仔鱼阶段结束。经过30d的生长和发育,进入幼鱼阶段;此时平均全长达37mm,其形态特征和生态习性均与成鱼相似。