工业用糖蜜酿酒酵母菌株耐受性分析研究

采用休止细胞梯度生长法,对工业糖蜜酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株进行高浓度酒精、高温和高渗透压,以及糠醛毒性、苯酚毒性、乙酸毒性和抗生素G418毒性的耐受性分析.结果表明,所测定的工业酵母菌株对这些逆境条件的耐受性有明显的差别;其中AS2.1189和AS2.1190对测定的胁迫条件均表现出相对较好的耐受性;396对乙酸毒性和G418毒性具有很好的耐受性;2610对高温表现出较强的耐受性.     

改造噬菌体提升抗生素药效

美国科学家通过对噬菌体进行改造,使之能够抑制细菌对抗生素的耐受性。如果将其与抗生素联合使用,还能杀死目前已存在的对抗生素广泛耐受的细菌。     

絮凝基因FLO1及FLO1c高表达提高工业酿酒酵母乙酸耐受性及发酵性能

乙酸是生物质乙醇发酵过程中酵母细胞面临的重要抑制剂之一,对细胞生长及发酵性能有强烈的抑制作用。增强酵母菌对乙酸胁迫的耐受性对提高乙醇产率具有重要意义。用分别带有完整絮凝基因FLO1及其重复序列单元C发生缺失的衍生基因FLO1c的重组表达质粒分别转化非絮凝型工业酿酒酵母CE6,获得絮凝型重组酵母菌株6-AF1和6-AF1c。同时以空载体p YCPGA1转化CE6的菌株CE6-V为对照菌株。与CE6-V相比,絮凝酵母明显提高了对乙酸胁迫的耐受性。在0.6%(V/V)乙酸胁迫下,6-AF1和6-AF1c的乙醇产率分别为对照菌株CE6-V的1.56倍和1.62倍;在1.0%(V/V)乙酸胁迫下,6-AF1和6-AF1c的乙醇产率分别为对照菌株CE6-V的1.21倍和1.78倍。可见絮凝能力改造能明显提高工业酿酒酵母的乙酸胁迫耐受性及发酵性能,而且FLO1内重复序列单元C缺失具有更加明显的效果。     

假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性

【目的】研究假坚强芽胞杆菌OF4中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶学特性。【方法】通过引物设计,采用PCR技术从嗜碱芽胞杆菌OF4的基因组DNA中扩增获得乙醇脱氢酶(adh)基因和乙醛脱氢酶(aldh)基因,构建表达载体,通过异源原核表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】乙醛脱氢酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,酶蛋白的活力为979.6 U/mg,其稳定性在25℃和35℃下比45℃稍好;尽管由于乙醇脱氢酶的表达量低而未能纯化获得酶蛋白,但通过双基因共表达及乙醇耐受性实验发现乙醇脱氢酶也具备较高的催化活性。【结论】成功地从假坚强芽胞杆菌OF4中克隆获得了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因,二者共同作用能够较大提高宿主对乙醇的耐受性。     

低氧预处理提高离体培养的下丘脑细胞缺氧耐受性及其与线粒体膜电位稳定性的关系

本文用新生大鼠下丘脑培养细胞,研究了低氧预处理对下丘脑细胞缺氧耐受性的影响及其与线粒体膜电位的关系.结果显示：在急性缺氧条件下,低氧预处理可以提高细胞存活率,减少乳酸脱氢酶漏出,此外,低氧预处理可以使线粒体膜电位在缺氧时保持相对高的水平,并诱导B淋巴细胞／白血病－2（B-cell lymphoma/leukemia-2,bcl-2)高表达,结果提示,低氧预处理能提高下丘脑细胞的缺氧耐受性,其机制与线粒体膜电位稳定性增强有关;低氧预处理诱发bcl-2高表达可能是线粒体膜电位稳定性增强的机制之一。     

微生物耐受乙醇与丁醇机制及其在生物燃料生产与生物转化中的应用

生物法获取乙醇与丁醇过程中有机溶剂的毒性是生产菌重要环境胁迫因素之一,且当有机溶剂超过一定浓度时便会抑制微生物的生长,甚至引起微生物的死亡,因此提高工业微生物的有机溶剂耐受性对工业生产具有重要的意义。对微生物乙醇及丁醇耐受机制的研究可为选育具有较强溶剂耐受菌提供理论基础。本文系统介绍了微生物耐受乙醇与丁醇的机制,并对其在生物燃料生产及生物转化中面临的机遇与挑战等问题进行简要的评述。     

pH对中华小长臂虾存活及呼吸代谢的影响

为研究中华小长臂虾(Palaemonetes sinensis)对pH的耐受性,采用静水毒性实验方法确定了中华小长臂虾的半致死pH。实验设置酸性条件下的pH为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8和4.0,碱性条件下的pH为10.4、10.6、10.8、11.0、11.2和11.4,统计中华小长臂虾在24、48、72和96 h的死亡率。中华小长臂虾24、48、72和96 h的酸性半致死pH(LpH50)分别为3.416、3.426、3.463和3.463,碱性半致死pH(LpH50)分别为10.813、10.609、10.516和10.516,酸性条件下和碱性条件下的安全pH分别为4.463和9.516。在半致死pH(LpH50)基础上以静水密闭式方法研究了pH对中华小长臂虾耗氧率、排氨率和窒息点的影响,pH设置为4、5、6、7、8、9、10,以pH 7为对照组。与对照组相比,只有pH为9和10时的耗氧率显著升高(P0.05),其他pH则未发生显著性变化(P0.05);排氨率则只有pH为5和6时显著高于对照组(P0.05),其他pH组与对照组没有显著性变化(P0.05);在pH为4~9时,中华小长臂虾氧氮比(O/N)的变化范围为4.14~10.95,此时以蛋白质为主要供能物质,随着pH继续上升到10时,中华小长臂虾的氧氮比(O/N)突然增加至29.62,此时供能物质则变成以脂肪为主;在各pH条件下窒息点没有发生显著性变化(P0.05)。本实验结果表明,中华小长臂虾对pH有很强的耐受性,但不同的pH会影响到中华小长臂虾的呼吸代谢以及能量供给方式。     

双歧杆菌四联活菌体外模拟消化液耐受性的考察

考察双歧杆菌四联活菌中4种益生菌在模拟消化液中的耐受性。

按照现行版《中国药典》配制人工胃液与人工肠液,将4种益生菌分别加入其中,充分混匀,孵育0、15、30、60、90、120、180 min后,稀释、涂布与计数,绘制每种菌存活的衰减曲线,考察其存活率。

在人工胃液（pH 2.5～4.5）孵育3 h后,长双歧杆菌婴儿亚种（GMCC 0460.1）、嗜酸乳杆菌（GMCC 0460.2）、粪肠球菌（GMCC 0460.3）、蜡样芽胞杆菌（GMCC 0460.4）的存活率分别为53.23%～61.30%、75.31%～105.34%、90.76%～100.00%、81.02%～102.58%;在人工肠液（胆汁盐浓度0.03%～0.20%）孵育3 h后,长双歧杆菌婴儿亚种、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌的存活率分别为42.19%～71.49%、16.62%～45.03%、40.80%～69.50%、42.67%～95.43%。

4种益生菌在较长时间内耐受人工胃液（pH 2.5～4.5）和人工肠液（胆汁盐浓度0.03%～0.20%）,菌体存活量下降不到1个数量级,对胃酸和胆盐的耐受性较强。由于健康人体内胃肠的环境类似于上述环境,预示其在健康人体消化道内能较好保持菌体生存能力,发挥药效活性。

     

白地霉Y162脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

借助生物信息学,对已克隆的地霉属脂肪酶全长基因序列进行同源比对,根据保守序列设计引物,在基因组DNA和cDNA水平上,于国内首次克隆了Geotrichum candidum Y162脂肪酶基因.Gcandidum Y162脂肪酶基因全长1692bp,不含内含子,编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸.与NCBI GenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列有86%的一致性.将该基因克隆到pPIC9K表达载体上,转化毕赤酵母GS115,摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌表达55 U/mL重组脂肪酶,实现了脂肪酶的高效表达.酶学性质研究表明,该重组脂肪酶对C9位顺式双键的甘油酯具有明显的底物特异性;对甲醇、甘油等有机溶剂呈现耐受性;最适温度和最适pH分别为50℃和8.0,在pH6.0～10.0及60℃以下能保持60%以上的酶活力.底物特异性、有机溶剂、温度及pH耐受性赋予该重组酶良好工业应用潜力.     

链霉菌GXT6 β-葡萄糖苷酶的酶学性质及葡萄糖耐受性分子改造

【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。