AP-1在AngⅡ正反馈调节其前体基因表达中的作用

血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可诱导其前体基因在血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMC)中进行表达,其作用机制与促进转录激活蛋白-1(activatingprotein-1,AP-1)的基因调控区中存在的AP-1位点结合有关.为进一步明确AngⅡ调节AP-1结合活性的分子机制,用放线菌酮(cycloheximide,CHX)作为c-Jun磷酸化抑制剂,经DNA-蛋白质相互作用和蛋白质印迹实验,探讨AngⅡ对AP-1结合活性的影响并探讨其分子机制.结果表明,受AngⅡ刺激的VSMC,其核蛋白中AP-1的组成亚基之一c-Jun水平明显升高.免疫细胞化学染色显示,在被AngⅡ处理的细胞中,c-Jun主要定位于细胞核,胞浆中几乎检测不出该转录激活蛋白的存在.用丝氨酸磷酸化抗体检测证实,AngⅡ可诱导c-Jun磷酸化.电泳迁移率改变分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)显示,c-Jun的磷酸化水平与AP-1结合血管紧张素原基因顺式元件的活性,和对该基因的转录激活作用呈正相关关系,CHX通过阻断c-Jun磷酸化抑制AngⅡ诱导的AP-1结合活性,但是不影响c-Jun的表达水平.上述结果提示,AP-1的磷酸化活化是AngⅡ正反馈调节其前体基因表达的重要机制之一,首次发现CHX是c-Jun磷酸化的抑制剂.     

大鼠肺动脉平滑肌细胞缺氧后STAT3活性变化与细胞增殖关系的研究

目的：探讨信号转导及转录活化因子3（STAT3）对缺氧大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响及作用机制。方法：组织块法原代培养PASMCs,用AG490预孵育后进行缺氧处理,半定量RT-PCR,Westernblot法分别检测缺氧2h、6h、12h、16h、24h组STAT3酪氨酸活性水平变化;半定量RT-PCR检测缺氧条件下上述时相点c-mycmRNA水平变化;^3H-TdR掺入法观察缺氧条件下细胞增殖变化。结果：Western blot定量分析显示缺氧培养6h组STAT3酪氨酸磷酸化水平升高,12h组达高峰,16h略有下降;缺氧培养2h组c-mycmRNA表达升高,4h达高峰,6h下降,12h恢复至正常水平;^3H-TdR掺入法结果显示缺氧6h组细胞^3H-TdR掺入量的增加,并随缺氧时间延长变化更为显著。AG490抑制缺氧诱导STAT3酪氨酸磷酸化及c-mycmRNA表达。结论：①STAT3活化和c-myc表达参与缺氧PASMcS增殖;②在缺氧PASMCs增殖过程中STAT3上调c-myc表达。     

Polymer-based delivering of shRNA to rabbit aortic smooth muscle cells suppressed the expression of IGF-1R in vitro and in vivo

Restenosis is one of clinical limitations for vein graft in coron- ary bypass graft. It has been proved that signal pathway IGF-1 and its receptor （IGF-1R） activated by hemodynamic mechanical stretch are responsible for the vascular smooth muscle cells proliferation in vein graft neointima formation. Unfortunately, there is no routinely successful method to resolve this problem. Gene delivering to vein graft possesses great therapeutic potential to prevent neointima formation. Polymer is one kind of nanoparticles, which can activate the process of endocytosis of cells. In this study, we evaluated the transfeetion efficiency and therapeutic potential of polymer- based transfection of plasmids expressing GFP and shRNAs targeting IGF-1R （pGFPshlGF-1Rs） to smooth muscle cells and rabbit external jugular vein graft. Results showed that polymer-based transfection provided high efficiency of trans- gene expression in smooth muscle cells in vitro. In vitro, IGF- 1R-specific shRNA transfected by polymer inhibited IGF-1R protein expression by 52 ±3.6%, when compared with mock transfected cells. In vivo delivering efficiency of pGFPshlGF-IR plasmid into the rabbit external jugular vein graft was significantly high in the polymer-based trans- fection group, when compared with negative control group. In vivo, polymer-based transfection IGF-1R-specific shRNA efficiently inhibited the expression of IGF-1R protein by 77 ± 3.6%, 65.6 ± 4.9%, and 76.7 ± 4.3% at 24, 48, and 72 h, respectively, when compared with negative control group. Our findings indicated that polymer-based transfec- tion may be a promising technique that allows the targeting of gene therapy for vein graft restenosis.     

大鼠胃纵行和环行平滑肌对细胞外核苷引起的差异收缩反应

目的：观察几种细胞外核苷如ATP、urIP和四磷酸脲腺苷（Up4A）在胃纵行平滑肌（Ⅲ）和胃环行平滑肌（CM）中引起不同的反应,P2X和P2Y受体拮抗剂以及环氧合酶抑制剂五磷酸二肌苷（11＇5I）、苏拉明（suramin）和吲哚美辛对№A在删和CM中引起的收缩的影响。方法：取大鼠全胃,分离LM和CM,使用organbath系统测量平滑肌收缩。结果：Up4A可以在I_aM和CM中引起与ATP和U1P类似的收缩;IP5I对LM和CM中由Up4A引起的收缩并无影响;但suramin和吲哚美辛则能在CaM中显著抑制由Up4A引起的收缩,而LM中无此现象。结论：两种胃平滑肌对核苷类药物及其抑制剂的反应有差异。     

纳豆枯草杆菌培养滤液对家兔离体肠平滑肌的作用

目的观察纳豆枯草杆菌培养滤液（culture filtrate,CF）对家兔离体肠平滑肌的作用,并初步探讨其作用机制。方法制备兔离体回肠标本,分别记录肠平滑肌的正常收缩张力和收缩频率作为给药前对照,然后按累积剂量分别加入CF小剂量（每次0．2mL）、CF大剂量（每次0．5mL）、肉汤（每次0．5mL）,给药间隔3min,共给药8次,并描记收缩曲线。观察不同剂量cF对肠平滑肌的作用。另取肠段按毛果芸香碱、CF或阿托品、再毛果芸香碱的顺序给药,观察CF对M胆碱受体的作用。结果CF小剂量组在累积给药达1．6mL时,CF大剂量组在累积给药达3．5mL和4．0mL时,兔离体肠平滑肌收缩张力下降,与给药前比较差异有统计学意义（P〈0．05）,其余各点差异均无统计学意义（P〉0．05）。CF小剂量组在累积给药达1．2、1．4、1．6mL时,CF大剂量组在累积给药达4．0mL时,兔离体肠平滑肌收缩频率明显降低,与给药前比较差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）,其余各点差异均无统计学意义（P〉0．05）。CF或阿托品可明显对抗毛果芸香碱引起的兔离体肠平滑肌收缩张力的增加（P〈0．05或P〈0．01）,同时CF还能使其收缩频率明显减少（P〈0．01）。结论纳豆枯草杆菌CF能明显抑制兔离体肠平滑肌蠕动,其作用机制可能与阻断M胆碱受体有关。     

细胞生成素3'端增强子在肺动脉平滑肌细胞低氧性增殖调控中的作用

用噻唑蓝比色法(MTT法)、H3-胸腺嘧啶核苷(H3-TdR)掺入法和流式细胞术, 观察红细胞生成素(EPO)3'端增强子片段对培养的猪肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的内皮依赖性和非内皮依赖性低氧性增殖的影响.结果为: (1)低氧24 h后PASMCs明显增殖, 转入野生型EPO3'端增强子片段可被抑制, 而转入突变型片段无此作用;(2)肺动脉内皮细胞(PAECs)低氧24 h, 其条件培养液有明显的促PASMCs增殖作用, 将野生型EPO3'端增强子片段先转入PAECs, 此作用明显减弱, 而转入突变型片段则无明显影响.提示: (1)PAECs低氧条件培养液可促进PASMCs增殖, PASMCs也可直接感受低氧而增殖, PAECs和PASMCs的低氧反应均被外源性EPO3'增强子片段抑制;(2)由于EPO3'增强子上有低氧诱导因子-1(HIF-1)结合位点, PAEC和PASMC低氧反应可能是通过HIF-1低氧信号转导的共同通路.     

血啉甲醚在动脉组织的吸收分布特性

本研究观察血啉甲醚（ＨＭＭＥ）在血管平滑肌细胞（ＳＣＭ）、血管内皮细胞（ＥＣ）和动脉组织中的分布特点,旨在为建立防治血管成形术后再狭窄的光动力学疗法提供实验依据。将体外培养的ＥＣ和ＳＭＣ接种于２４忆培养板中,分组,培养液中加入ＨＭＭＥ,浓度为２０、４０、６０、８０、１００μｇ／ｍｌ,孵育１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０ｍｉｎ后,采用荧光摄象分析法测定细胞内ＨＭＭＥ含量。以ＨＭＭＥ的孵育浓度     

细胞因子对血管平滑肌细胞MMP-2基因表达的诱导及其作用机制研究

为了探讨血管平滑肌细胞 ( VSMC)基质金属蛋白酶 - 2 ( MMP- 2 )基因的表达调控机制 ,利用Northern印迹杂交和 MMP- 2活性酶图分析检查 b FGF、TNF- α和 IL- 1 β对 VSMC MMP- 2基因表达的影响 ,应用电泳迁移率改变实验 ( EMSA)和 CAT分析对其作用机制进行研究 .结果证实 ,3种细胞因子均能显著诱导 MMP- 2基因表达 ,其作用强度依次为 b FGF>TNF-α>IL - 1β.将 MMP-2基因 5′侧翼 - 61 9～ 1 9bp调控序列克隆进携带报告基因的重组质粒 p SV0 - CAT后 ,经转染VSMC及 CAT分析显示 ,在上述 3种细胞因子的作用下 ,该调控序列可激活 cat基因表达 ,三者促进 cat表达的活性与其诱导 VSMC表达 MMP- 2的结果相一致 ;EMSA结果显示 ,被 b FGF和TNF- α刺激的 VSMC中产生与该基因调控区序列特异结合的转录调控因子 .提示细胞因子除可激活 VSMC细胞周期调节基因表达外 ,还可通过诱导 MMP- 2表达而发挥其对细胞外基质代谢的调节作用及参与 VSMC迁移的启动过程 ;细胞因子对 VSMC MMP- 2基因表达的诱导作用是通过促进转录调控因子的合成或活化而实现的 .     

pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白, TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

Caveolin-1与血管平滑肌细胞信号转导

微囊蛋白家族是近年来引人关注的细胞膜信号转导调节因子,在多条信号转导过程中起着枢纽作用,其标志性的结构蛋白caveolin对许多关键信号分子的活性状态起着直接的调节作用。微囊蛋白表达异常可诱导动脉粥样硬化、心肌肥厚、肿瘤、糖尿病、膀胱功能异常、肌营养不良等多种疾病的发生。血管平滑肌细胞膜上主要表达微囊蛋白-1(caveolin-1),提示它可能参与平滑肌细胞膜内外的重要信号转导机制。