人肝癌细胞株H9101的建立及其细胞生物学特性研究

从厦门市肝癌高发的同安地区肝癌病人肝癌组织建立了人原发性肝细胞癌细胞系H9101.它生长迅速,群体倍增时间平均为38小时,对小牛血清的依赖性较低(1%).体外培养的H9101细胞贴壁生长,扫描和透射电镜下见细胞有丰富细长微绒毛.H9101细胞具有较高的软琼脂克隆形成率(1/200细胞)和裸鼠异种移植成瘤能力(100%).瘤细胞在ConA处理后呈较强的凝集性,在ConA 50ug/ml和100μg/ml时细胞凝集率分别为61%和92%.瘤细胞分泌微量的AFP,用1%DMSO和1.5×10-5mol/L地塞米松处理10天后上升到(140ng/ml/1×105细胞/24小时),且HBsAg转呈阳性.H9101细胞γ-谷氨酰转肽酶活性达5.42U±0.11U/mg,酪氨酸α酮戊二酸转肽酶活性达14.24U±1.50U/mg,与正常人肝细胞者相比差异显著(分别为P＜0.001和P＜0.01).H9101细胞染色体数为非整倍体,众数分布在52条-82条,具人类细胞染色体特征,其DNA经PCR扩增显示HBV DNA特异性条带.H9101细胞具端粒酶活性,是细胞连续传代和建系的保证;它恶性程度高、整合HBVDNA和具人肝细胞癌生物学基本特征,可为肝癌分子生物学研究提供有价值的实验材料.     

Calpain2对肝癌细胞浸润和转移能力的影响

目的：肝细胞癌（HCC）是一类常见的恶性肿瘤,主要表现为进展迅速、易复发及预后不良。侵袭转移作为肝癌的最主要的恶性表型,是造成较高致死率的主要原因。Calpain是钙激活中性蛋白酶,广泛参与了细胞多种生命过程。其中Calpainl和Calpain2是Calpain家族主要成员,对于维持肿瘤细胞恶性表型有重要作用。本研究通过RNA干涉技术下调人肝癌Huh7细胞中Calpain2基因的表达,检测下调Calpain2对人肝癌Huh7细胞黏附,侵袭和迁移能力的影响,明确Calpain2在人肝癌细胞浸润和转移过程中的作用。方法：合成Calpain2的RNAi片段,瞬时转染人肝癌细胞Huh7,降低Hull7细胞中Calpain2的表达,运用细胞黏附实验,细胞侵袭实验及划痕愈合实验检测干涉Calpain2对肝癌细胞的黏附,侵袭和迁移能力的影响。结果：合成Calpain2的RNAi片段。瞬时转染人肝癌细胞Huh73,36小时后,细胞中Calpain2的蛋白水平明显下降,干涉Calpain2后人肝癌细胞Huh7的黏附率,侵袭率及划痕修复率的显著下降。结论：以上实验结果表明Calpain2能够促进肝癌细胞黏附,侵袭及划痕修复能力,Calpain2能够促进肝癌细胞的浸润和转移的作用,是肝癌发生发展过程中的肿瘤促进因子。因此,Calpain2可以作为抑制肝癌侵袭和转移的潜在靶点,靶向Call＇ain2的药物可能成为治疗肝癌侵袭转移的新方法。     

ASM对异常黑胆质肝癌移植大鼠模型的干预

目的:探讨移植法制备异常黑胆质肝癌模型的可行性及维药异常黑胆质成熟剂(ASM)对肿瘤的干预作用。方法:用随机法将雄性SD大鼠分为正常对照组、模型对照组、病症模型组以及ASM药物治疗组(低、中、高剂量),正常对照组行假肝癌移植术(肝内注射生理盐水);模型对照组采用移植法将walker-256腹水瘤细胞进行肝内接种,建立肝癌模型;病症模型组首先采用多重因素(干寒饲养、足底刺激、铁管制动等)诱导制备异常黑胆质证大鼠模型,在此基础上进行肝内接种walker-256腹水瘤细胞,建立异常黑胆质证肝癌大鼠模型;ASM药物治疗组分为低、中、高不同剂量组(2.53,5.06,10.12 g/kg),异常黑胆质证大鼠接种瘤细胞后给予ASM灌胃治疗。2 w后处死取材,观察各组大鼠肿瘤发生情况、肿瘤体积、腹水形成率及腹壁后转移率;通过光镜及电镜观察各组大鼠肝癌组织肿瘤细胞形态结构变化。结果:模型对照组与病症模型组大鼠在肿瘤发生率、腹壁后转移率及肿瘤体积大小方面无显著差异(P0.05);与模型对照组相比,病症模型组大鼠腹水形成率显著增高,差异有统计学意义(P0.05);与病症模型组相比,低、中剂量ASM可以显著减小肿瘤体积、降低腹水形成率及腹壁后转移率(P0.05),而高剂量ASM组仅有腹水形成率显著降低(P0.05),肿瘤体积及腹壁后转移率无明显变化;光镜及电镜下观察可见,不同剂量ASM治疗组大鼠肿瘤细胞的水肿程度增加,瘤细胞发生变性坏死,其周围炎性细胞浸润明显增多。结论:异常黑胆质可能促进肝癌腹水形成和转移,从而影响肝癌的发展及转归;ASM对肿瘤细胞有一定损伤,可以减少肝癌腹水形成和转移,从而起到一定的抗肿瘤作用,影响肿瘤转归。     

腹腔镜精准肝切除对原发性肝癌患者肝功能、免疫功能及炎性因子的影响

目的:探讨腹腔镜精准肝切除对原发性肝癌(PHC)患者肝功能、免疫功能及炎性因子的影响。方法:选取2013年2月~2018年12月期间我院收治的PHC患者117例,按随机数字表法分为对照组(n=58)和研究组(n=59),对照组给予开腹常规肝切除术治疗,研究组给予腹腔镜精准肝切除治疗。比较两组患者围术期指标、肝功能、免疫功能、炎性因子、并发症。结果:研究组术中出血量少于对照组,住院时间短于对照组(P<0.05);两组手术时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者术后谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)均升高,但研究组低于对照组(P<0.05);两组患者术后白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)水平均升高,但研究组低于对照组(P<0.05);两组患者术后CD3^+、CD4^+、CD4^+/CD8^+均降低,但研究组高于对照组(P<0.05);CD8^+升高,但研究组低于对照组(P<0.05)。研究组术后并发症发生率低于对照组(P<0.05)。结论:腹腔镜精准肝切除治疗有助于保护PHC患者肝功能、免疫功能,改善炎性因子水平并减少术中出血量、住院时间,同时还可减少并发症发生率。     

HCV5NCR转基因细胞模型的建立

缺乏合适的ＨＣＶ感染细胞及小动物模型,是抗ＨＣＶ药物研究和开发的主要障碍之一。建立一种ＨＣＶ５ＮＣＲ调控荧光素酶基因的转基因细胞模型,可为以ＨＣＶ５ＮＣＲ及Ｃ基因５’端为靶的反义寡核苷酸及特异性核酶等抗ＨＣＶ药物的评价及筛选创造条件。     

人胎盘型谷胱甘肽S-转移酶的ELISA及用于肝癌的诊断

从人体胎盘提纯GST-π,制备兔抗GST-π血清,纯化其IgG,并降解成Fab′片断,通过SMCC与HRP交联成Fab′-HRP,用于夹心ELISA以测定GST-π,灵敏度可达11pg,超过国外的放射免疫法。用此法测定正常人血清GST-π为1.06±0.94ng/ml,原发性肝癌血清较正常高20倍以上。阳性率达90％左右。     

Smo 蛋白在肝癌和肝硬化中的表达及临床意义

目的:研究Smoothened(SMO)在肝癌和肝硬化中的表达及临床意义。方法:选取组织标本后,运用石蜡包埋,切片后,HE染色,构建组织芯片,免疫组织化学和原位杂交方法检测Smo蛋白在肝癌和肝硬化中的表达。结果:Smo蛋白在肝癌细胞浆、良性肝肿瘤组织细胞浆、肝硬化组织中强染色,在正常组织中无染色。并且在典型肝硬化中强染色,在中度肝硬化中弱阳性。结论:Smo蛋白表达与肝癌的发生有关,Smo基因的高表达可能激活某种机制而参与诱导肝癌的发生。可能是通过异常激活Sonic hedgchog信号通路,从而诱导肝癌的发生与发展。     

罗格列酮对裸鼠移植性人肝癌细胞生长的抑制作用

目的:研究罗格列酮(rosiiglitazone,ROZ)对裸鼠体内人肝癌SMMC7721细胞增殖的影响.方法:建立人肝癌裸鼠移植瘤模型,实验动物分为罗格列酮治疗组及对照组.观察罗格列酮对移植瘤体积和重量的变化,采用光镜观察移植瘤细胞形态学变化,流式细胞术检测移植瘤细胞周期分布,免疫组织化学和蛋白印迹检测瘤组织内增殖细胞核抗原(proliferating cellnuclear antigen,PCNA)蛋白表达变化.结果:罗格列酮在体内能明显抑制移植瘤的生长,抑瘤率为50.81%;组织学显示治疗组瘤细胞异型性降低,核质比下降;流式细胞术分析显示,对照组移植瘤细胞处于G2/M期细胞为13.1%,与对照组比较,治疗组处于G2/M期细胞显著增多(29.1%).免疫组织化学和蛋白印迹检测均显示检测显示,经罗格列酮处理后,裸鼠移植瘤组织PCNA蛋白表达明显下调(P＜0.05).结论:罗格列酮可体内抑制人肝癌SMMC7721细胞增殖,并使癌细胞阻滞于G2/M期.     

自发性可移植性615小鼠肺癌和肝癌组织神经节苷脂高效薄层层析图谱的分析

本文研究了615近交系小鼠的自发性可移植性肺癌(P_(615))和肝癌(H_(615))组织中神经节苷脂结合唾液酸含量和神经节苷脂图谱。P_(615)和H_(615)癌组织中GLS结合唾液酸含量均比正常对照为高,分别为对照组织的2.9倍和1.9倍。615小鼠的正常肺组织和肝组织的GLS主要成分均为GM_3。在P_(615)和H_(615)癌组织中GM_3含量均明显减少。肺癌组织中GM_2大量增加,肝癌组织中不仅GM_2明显增加,GM_1和GD_(18)也明显增加。P_(615)和H_(615)这两种分化程度较高、恶性程度较低的癌组织GD_3的百分含量比正常对照组织略有降低。本文结果提示,自发性可移植性P_(615)和H_(615)肿瘤组织中不仅神经节苷脂含量(以唾液酸量计)升高,而且GLS的组分也发生改变。GM_3含量减少和GM_2含量增高可能与肿瘤的恶性生长和分化程度有关。     

磺酰化乳糖基神经酰胺表达水平对肝癌细胞转移潜能的影响

研究磺酰化乳糖基神经酰胺（SM3）的表达水平与肝癌细胞转移潜能的关系.采用免疫荧光染色和细胞酶联免疫两种方法,观察了不同转移潜能的肝癌细胞中磺酰化乳糖基神经酰胺的表达水平,发现高转移性肝癌细胞表达SM3的水平明显高于低转移性肝癌细胞.高转移性肝癌细胞经过10 μmol/L维甲酸处理,抑制肝癌细胞的转移潜能以后,SM3的表达水平显著下降（P＜0.05）,接近低转移性肝癌细胞水平,但是SM3的前体分子半乳糖基神经酰胺水平并不降低,提示磺酰化作用受到了抑制.通过脑苷脂磺酰基转移酶(CST)基因的转染,使Hep3B肝癌细胞高表达SM3.发现CST转染的肝癌细胞与转移相关的行为显著改变,经黏附试验发现,CST基因转染的肝癌细胞对层粘连蛋白和玻连蛋白（vitronectin）的黏附显著增强,比未转染的或转染载体的肝癌细胞升高3～4倍.裸鼠体内试验表明,这种具有高度表达CST基因的Hep3B细胞比对照组细胞具有更高的转移能力(P＜0.05).说明磺酰化乳糖基神经酰胺可能与肝癌细胞的转移有关.